一种沙门氏菌工程穿膜噬菌体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及生命科学技术领域，尤其涉及一种沙门氏菌工程穿膜噬菌体及其构建方法与应用。所述沙门氏菌工程穿膜噬菌体包括噬菌体和穿膜肽，所述噬菌体表面具有表面蛋白，所述表面蛋白与所述穿膜肽融合，所述表面蛋白为含有Ig

【技术实现步骤摘要】
一种沙门氏菌工程穿膜噬菌体及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及生命科学
，尤其涉及一种沙门氏菌工程穿膜噬菌体及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]鼠伤寒沙门氏菌作为第二大食源性感染致病菌，每年可引起约20万人死亡。其中鼠伤寒沙门氏菌致病机制主要涉及其可感染肠上皮细胞，并首先在细胞内形成包含沙门菌的囊泡后期可逃离至细胞质内进行大量繁殖，导致潜在的感染灶，造成感染的迁延不愈。此外鼠伤寒沙门氏菌除可入侵上皮细胞还可以感染吞噬细胞甚至成纤维细胞等。抗生素作为有效的治疗手段，随着其广泛使用，高耐药性鼠伤寒沙门氏菌出现并开始全球传播，并且由于细胞膜存在，抗生素难以渗透到细胞内达到有效的作用浓度，为胞内菌的有效杀伤带来极大的难度，所以临床上迫切需要寻找新的有效治疗鼠伤寒沙门氏菌感染的替代方式。
[0003]噬菌体作为细菌的天敌，可高效的靶向杀伤细胞外宿主菌。然而其对细胞内宿主菌的作用却鲜有报道。作为最丰富和最多样化的生物实体，噬菌体在环境和人体中无处不在，据报道在人类肠道中有高达2
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个噬菌体颗粒。越来越多的研究显示在通过口服或吸入噬菌体治疗时，噬菌体可广泛分布在人体各个器官，包括肝脏，脾脏，肾脏，心脏甚至脑组织，说明噬菌体有穿越细胞的潜力。近期越来越多的研究提示噬菌体可通过特异性或非特异性与哺乳细胞相互作用，进入细胞并稳定存在24小时，但入胞效率与噬菌体的形态、浓度、大小及不同细胞类型等因素相关，初步提示噬菌体可进入哺乳细胞内。
[0004]目前天然噬菌体进入细胞的能力十分有限，如何提高噬菌体入胞能力对胞内菌的治疗具有巨大的潜力。为了提高噬菌体穿过质膜和细胞内靶标的能力，人们一直在广泛考虑将噬菌体封装成包括脂质体、聚合物颗粒和纳米颗粒在内的载体的方法，然而化学修饰具有价格昂贵，耗时耗力等缺点。近年来随着合成生物学的快速发展，利用基因编辑技术获取穿膜肽（Cell
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penetrating peptide，CPP）展示工程噬菌体达到胞内菌杀伤成为可能。穿膜肽是由5
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30个氨基酸组成的小肽，具有携带包括DNA、RNA和蛋白质等大分子进入细胞内的潜力。作为一种经典的运输载体，CPP因其高效的内化能力及较低毒性备受医学应用的青睐。CPP种类繁多，最常见的是非特异性进入细胞的CPP，如 人 类 免 疫 缺 陷 病 毒HIV的 反 式 转 录 激 活 因 子 （Transactivator of transcription，TAT）、流感病毒血凝素蛋白（The influenza virus haemagglutinin protein，HA）、果蝇同源异型转录因子ANTP以及人工合成的多聚精氨酸和多聚赖氨酸等。Tao Pan等人通过在T4头部修饰蛋白hoc部位融合表达穿膜肽TAT实现了噬菌体的高效入胞。随着噬菌体基因编辑技术的快速发展，经过穿膜肽修饰从而实现噬菌体入胞具有巨大的前景。但目前关于穿膜肽融合的工作主要集中在大肠模式噬菌体。有学者提出利用基因编辑的方法结合噬菌体展示技术（Phage display technology）可有效的提高噬菌体的入胞效率。2018年Frances等三位科学家因噬菌体展示技术获得诺贝尔奖，该技术通过将编码随机短肽序列或蛋白质的核酸序列与编码噬菌体表面蛋白的基因融合后，随着噬菌体的传代，在噬菌体的表面以融合多肽或蛋白的
形式呈现，并保持相应的空间结构和生物活性。在疫苗研制、抗体制备等分子生物学领域具有举足轻重的作用。1990年Scott学者首次将大量随机基因序列融合到丝状噬菌体表面成功构建了第一个噬菌体展示的随机肽库。近年来噬菌体展示技术得到极大发展，利用噬菌体展示技术筛选靶向血管的肽段 RGD、NGR及SFITGv6以便于癌症治疗；Mann利用CX7C T7噬菌体文库进行筛选的靶向结缔组织生长因子（CTGF/CCN2）的靶向肽段DAG可用于阿尔兹海默症的诊断；利用T7噬菌体展示随机肽库筛选到选择性肿瘤抑制剂K
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RAS，可用于开发癌症相关信号通路抑制剂等。
[0005]噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。然而目前关于噬菌体展示技术主要是在大肠杆菌相关模式噬菌体开展，并基于明确的蛋白结构基础。而自然界中噬菌体数量多达10
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，噬菌体数量庞大，噬菌体多样性高，对可匹配修饰的结构蛋白了解甚少及众多未知基因等因素极大的限制了非模式噬菌体展示工作的开展。
[0006]因此，现有技术还有待于改进和发展。

技术实现思路

[0007]鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种沙门氏菌工程穿膜噬菌体及其构建方法与应用，旨在解决现有噬菌体进入细胞效率低下的问题。
[0008]本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供的一种沙门氏菌工程穿膜噬菌体，其中，包括噬菌体和穿膜肽，所述噬菌体表面具有表面蛋白，所述表面蛋白与所述穿膜肽融合，所述表面蛋白为含有Ig
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like结构域的蛋白。
[0009]可选地，所述表面蛋白为GP94蛋白。
[0010]可选地，所述穿膜肽包括HA
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TAT、cTAT、Intergrin、R8、R7、P8和Transportan中的一种。
[0011]进一步可选地，所述穿膜肽为HA
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TAT。
[0012]本专利技术利用噬菌体展示技术，其原理是将编码多肽的DNA片段与噬菌体衣壳蛋白编码基因进行重组，并以融合蛋白的形式表达在噬菌体的表面。具体的，本专利技术通过生物信息学方法在鼠伤寒沙门氏菌噬菌体的结构蛋白中高通量筛选出适用于与外源蛋白融合表达的蛋白，即含有Ig
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like结构域的蛋白，随后让鼠伤寒沙门氏菌噬菌体表面融合表达细胞穿膜肽，获得可以高效杀伤细胞内鼠伤寒沙门氏菌的工程穿膜噬菌体，提高鼠伤寒沙门氏菌噬菌体进入细胞的效价，将噬菌体疗法扩展到对细胞内感染的治疗。
[0013]具体的，本专利技术使用HMMER3生信软件中的hmmscan命令搜索并筛选出含有Ig
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like结构域的蛋白。进一步，经AlphaFold2预测鼠伤寒沙门氏菌SL7207的噬菌体中GP94蛋白的结构，提示该蛋白包括3个结构域，其中2个为Ig
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like结构域。因此，GP94蛋白具有噬菌体展示的潜力。
[0014]第二方面，本专利技术提供的一种本专利技术所述的一种沙门氏菌工程穿膜噬菌体的构建方法，其中，包括如下步骤：
构建含同源臂、CPP和SgRNA的重组pDonor质粒；将spCas9质粒和所述重组pDonor质粒电转入宿主沙门氏菌中，得到含双质粒的宿主菌；将野生型噬菌体在所述含双质粒的宿主菌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种沙门氏菌工程穿膜噬菌体，其特征在于，包括噬菌体和穿膜肽，所述噬菌体表面具有表面蛋白，所述表面蛋白与所述穿膜肽融合，所述表面蛋白为含有Ig
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like结构域的蛋白。2.根据权利要求1所述的一种沙门氏菌工程穿膜噬菌体，其特征在于，所述表面蛋白为GP94蛋白。3.根据权利要求1所述的一种沙门氏菌工程穿膜噬菌体，其特征在于，所述穿膜肽包括HA
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TAT、cTAT、Intergrin、R8、R7、P8和Transportan中的一种。4.根据权利要求3所述的一种沙门氏菌工程穿膜噬菌体，其特征在于，所述穿膜肽为HA
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TAT。5.一种权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：马迎飞，谭新，赵敏，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：