一种能通过血脑屏障并且减轻急性低压缺氧脑损伤的腺相关病毒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种能通过血脑屏障并且减轻急性低压缺氧脑损伤的腺相关病毒及其应用，属于病毒基因工程技术领域。将MICU1的编码基因(序列如SEQ ID NO.1所示)作为目的基因插入pHBAAV

【技术实现步骤摘要】
一种能通过血脑屏障并且减轻急性低压缺氧脑损伤的腺相关病毒及其应用


[0001]本专利技术属于病毒基因工程
，具体涉及一种能通过血脑屏障并且减轻急性低压缺氧脑损伤的腺相关病毒及其应用。

技术介绍

[0002]腺相关病毒(adeno
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associated virus，AAV)，是微小病毒科依赖病毒属，病毒颗粒大小约为20～26nm，完整的生命周期需要辅助病毒(通常为腺病毒或疱疹病毒)参与。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。其中cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV有多种血清型，不同血清型对不同组织的亲和力不同，适用于各种体内感染实验。由于AAV的安全性能好和表达时效长的优点，目前已成为最有前景的基因治疗工具。AAV包装系统分为3质粒，其中包括可以插入外源基因的穿梭质粒，以及编码rep和cap蛋白编码基因的pAAV
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RC，以及替代腺相关病毒所依赖的腺病毒的pHelper质粒。3种质粒共转染工具细胞AAV
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293后，可以形成携带有外源插入基因的AAV病毒颗粒。
[0003]随着近年来进入高原的人群数量呈逐年上升趋势，高原特有的低压缺氧环境所造成的人体损害也逐渐受到更多关注。人体暴露在高海拔地区数小时或数日可导致一系列临床综合征。其中，急性低压缺氧导致的脑损伤作为最常见的急性高原反应之一，受到越来越多的关注。目前研究认为，多种机制参与急性低压缺氧脑损伤的发生发展，其中血
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脑屏障(Blood
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brain barrier，BBB)破坏以及脑血管舒缩功能异常在其中扮演重要角色。对于高原缺氧脑损伤而言，脑血管功能障碍在其中发挥重要作用。血管平滑肌细胞是构成血管壁的主要成分之一，其强大的生长加速潜能成为了众多血管源性疾病发生发展的关键因素，因而需要一种能够减轻急性低压缺氧导致的脑损伤的方法。
[0004]MICU1作为线粒体内膜上的钙离子感应蛋白，可以通过感受钙离子的浓度调节线粒体钙的摄入。因为钙稳态对于维持细胞正常的生理过程有着十分重要的意义，所以，MICU1对于线粒体钙的调节很大程度上影响了细胞的代谢、生长及凋亡等过程。

技术实现思路

[0005]为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种能通过血脑屏障并且减轻急性低压缺氧脑损伤的腺相关病毒及其应用，减轻急性低压缺氧暴露导致的脑损伤。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
[0007]本专利技术公开了一种腺相关病毒质粒，以AAVPHP.B质粒作为载体，以MICU1的编码基因作为目的基因转化而成；
[0008]其中，所述MICU1的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]优选地，所述AAVPHP.B质粒的ITR中间依次插入SM22a启动子、flag标签、T2A连接序列、荧光蛋白、WPRE转录后调控元件和polyA序列。
[0010]进一步优选地，所述AAVPHP.B质粒为pHBAAV
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SM22a
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3flag
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T2A
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ZsGreen载体。
[0011]进一步优选地，所述转基因载体质粒的构建方法为：将pHBAAV
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SM22a
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3flag
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T2A
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ZsGreen载体用BamHI和MluI进行酶切，并回收酶切产物，得到线性化表达载体；将目的基因与所述线性化的表达载体重组和转化，得到腺相关病毒质粒。
[0012]本专利技术还公开了一种能通过血脑屏障并且减轻急性低压缺氧脑损伤的腺相关病毒，以上述腺相关病毒质粒为核心质粒得到的腺相关病毒。
[0013]优选地，所述腺相关病毒的构建方法为：pAAV
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RC载体质粒、pHelper载体质粒和权利要求1～4任意一项所述的腺相关病毒质粒经过共转染293T细胞后，得到通过血脑屏障并且减轻急性低压缺氧脑损伤的腺相关病毒。
[0014]本专利技术还公开了一种能通过血脑屏障并且减轻急性低压缺氧脑损伤的腺相关病毒在制备减轻急性低压缺氧暴露导致的脑损伤的药物中的应用。
[0015]本专利技术还公开了一种能减轻急性低压缺氧脑损伤的药物，所述药物的主要活性成分为上述一种能通过血脑屏障并且减轻急性低压缺氧脑损伤的腺相关病毒。
[0016]优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体。
[0017]优选地，所述药物的剂型为针剂或冻干粉。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0019]本专利技术提供的一种能通过血脑屏障并且减轻急性低压缺氧脑损伤的腺相关病毒，以AAVPHP.B质粒作为载体，使腺相关病毒可经静脉注射的方式突破血脑屏障，将腺相关病毒传递到生物体的整个神经系统，以全局的方式靶向神经系统，具有非侵入性、广泛和持久的全神经系统表达的优势；以MICU1的编码基因作为目的基因，能够将血管平滑肌细胞中的MICU1表达上调，减轻急性低压缺氧暴露导致的脑损伤。通过急性低压缺氧脑损伤实验发现，本专利技术提供的腺相关病毒能够通过小鼠血脑屏障感染脑组织，明显改善小鼠急性低压缺氧暴露下导致的脑损伤情况，显著降低小鼠的脑组织凋亡细胞数。
[0020]进一步地，载体中包含血管平滑肌特异性启动子SM22 a，能够增强腺相关病毒的靶向性，使其具有组织特异性或细胞特异性。
附图说明
[0021]图1为本专利技术的pHBAAV
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SM22a
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3flag
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T2A
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ZsGreen载体图；
[0022]图2为本专利技术的阳性克隆的测序结果比对分析图；其中，绿色区域为与目的序列匹配部分；
[0023]图3为本专利技术的腺相关病毒包装的实验流程图；
[0024]图4为本专利技术的支原体检测结果图；其中，左侧为marker，右侧为检测结果；
[0025]图5为本专利技术的未经缺氧暴露的小鼠器官荧光成像结果图；其中，从左到右依次为、急性低压缺氧
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blank组、急性低压缺氧
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对照病毒组、急性低压缺氧
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目的病毒组和Color Scale；
[0026]图6为本专利技术使用α
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SMA、CD31、CD13以及AQP4分别对血管平滑肌细胞、内皮细胞、周细胞以及星形胶质细胞进行免疫荧光染色的结果图；
[0027]图7为本专利技术的尼式染色对急性低压缺氧脑损伤的病理组织学评估结果图；其中，A为急性低压缺氧
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blank组，B为急性低压缺氧
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对照病毒组，C为急性低压缺氧
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目的病毒组，标尺为50μm，D为损伤细胞占区域总细胞的比例，n＝6，数值以mean
±
SD表示，
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种腺相关病毒质粒，其特征在于，以AAVPHP.B质粒作为载体，以MICU1的编码基因作为目的基因转化而成；其中，所述MICU1的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的一种腺相关病毒质粒，其特征在于，所述AAVPHP.B质粒的ITR中间依次插入SM22a启动子、flag标签、T2A连接序列、荧光蛋白、WPRE转录后调控元件和polyA序列。3.根据权利要求2所述的一种腺相关病毒质粒，其特征在于，所述AAVPHP.B质粒为pHBAAV
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SM22a
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3flag
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T2A
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ZsGreen载体。4.根据权利要求3所述的一种腺相关病毒质粒，其特征在于，所述转基因载体质粒的构建方法为：将pHBAAV
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SM22a
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3flag
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T2A
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ZsGreen载体用BamHI和MluI进行酶切，并回收酶切产物，得到线性化表达载体；将目的基因与所述线性化的表达载体重组和...

【专利技术属性】
技术研发人员：常玮，薛军辉，李亚娟，满明昊，刘峰舟，刘美杰，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：