表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4

【技术实现步骤摘要】
表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是目前肆虐猪群的两个重大病原，均能引起免疫抑制性疾病。猪繁殖与呼吸综合征病毒感染猪群会引起发热，呼吸困难以及四肢皮肤出现斑点样充血或发绀，感染母猪后导致流产。猪圆环病毒2型感染后一般易引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)和猪皮炎与肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)。在临床上该两种病毒经常发生混合感染，对猪群的健康造成很大危害，给养猪业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫是控制这两种病发生与流行主要手段,目前市场上已有PRRSV和PCV2商品化疫苗。临床上对于上述两种疫病的防控，需要使用两种不同的疫苗进行分别免疫接种，由此造成免疫次数频繁、免疫干扰和过度应激等隐患，给疫病防控和健康养殖带来极大困扰。因此，研制“一针防两病”的PRRSV
‑
PCV2二联疫苗对于该两种疾病的防控具有重要意义。r/>
技术实现思路

[0003]本专利技术要解决临床上PRRSV和PCV2混合感染严重以及PCV2流行亚型逐渐进化，并且市面上暂时还没有针对这两种疾病的二联疫苗，导致疫苗保护效果不好和免疫程序复杂的技术问题，提供一种表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，该疫苗株是能同时防控猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒病并且安全有效的二联疫苗，达到一针防两病的效果。
[0004]此外，还需要提供一种上述表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株的制备方法和应用。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:
[0006]在本专利技术的一个方面，提供了一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4
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F112的基因组核酸，在该HuN4
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F112基因组的ORF1b和ORF2a之间插入有猪圆环病毒2型PCV2的Cap蛋白基因表达序列，所述PCV2的Cap蛋白基因表达序列为编码SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。
[0007]所述PCV2的Cap蛋白基因表达序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
[0008]其中，编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列、以及SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，是经过优化后的PCV2基因组中ORF2区的PCV2 Cap序列(PCV2 opCap序列)。
[0009]优选的，所述插入的PCV2 Cap蛋白基因表达序列的3
’
端，还连接有猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6转录调控序列，该转录调控序列为SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
[0010]在本专利技术的另一方面，还提供了一种核酸分子，包含连接有转录调控序列的PCV2 Cap蛋白基因表达序列，该PCV2 Cap蛋白基因表达序列为编码SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。
[0011]所述转录调控序列与PCV2 Cap蛋白基因表达序列的3
’
端相连接，该转录调控序列为猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6转录调控序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0012]在本专利技术的另一方面，还提供了一种核酸分子，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4
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F112的基因组核酸序列，在该HuN4
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F112基因组序列的ORF1b和ORF2a之间插入有PCV2 Cap蛋白基因表达序列，该PCV2 Cap蛋白基因表达序列为编码SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。
[0013]在本专利技术的另一方面，还提供了一种包含上述核酸分子的重组载体。
[0014]在本专利技术的另一方面，还提供了上述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株的制备方法，包括以下步骤：
[0015]构建包含上述核酸分子的重组载体；
[0016]将所述重组载体线性化后，体外转录成病毒RNA，再将该病毒RNA转染细胞；
[0017]将转染的细胞进一步接种于细胞上培养，进行病毒拯救，获得表达PCV2 Cap蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株。
[0018]在本专利技术的另一方面，还提供了一种疫苗组合物，包含上述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株。
[0019]在本专利技术的另一方面，还提供了上述重组猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株在制备预防或治疗高致病性猪繁殖与呼吸综合征和猪圆环病毒病的疫苗中的应用。
[0020]本专利技术表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，不仅能够稳定表达PCV2的Cap蛋白，而且具有遗传稳定性。该疫苗株免疫健康仔猪后能够刺激猪体产生高水平的PCV2特异性ELISA抗体，有望成为安全有效的猪繁殖与呼吸综合征与猪圆环病毒病的二联疫苗。
附图说明
[0021]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。
[0022]图1是本专利技术实施例2拯救的病毒感染Marc
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145细胞后的细胞病变图；
[0023]图2是本专利技术实施例2重组病毒的PCR鉴定结果图；
[0024]图3是本专利技术实施例2重组病毒的间接免疫荧光鉴定结果图；
[0025]图4是本专利技术实施例2重组病毒的Western blotting鉴定结果图；
[0026]图5是本专利技术实施例3重组病毒的生长曲线图；
[0027]图6是本专利技术实施例3重组病毒的蚀斑形态观察图；
[0028]图7是本专利技术实施例3的第3代、6代，9代，12代和15代重组病毒的PCR检测结果图；
[0029]图8是本专利技术实施例4重组病毒rHuN4
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F112
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Cap刺激猪体产生的PCV2 ELISA抗体水平结果图；
[0030]图9是本专利技术实施例5重组病毒rHuN4
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F112
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Cap株和rHuN4
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F112
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opCap株Cap蛋白
表达量对比结果图。
具体实施方式
[0031]下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，其特征在于，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4
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F112的基因组核酸，在该HuN4
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F112基因组的ORF1b和ORF2a之间插入有猪圆环病毒2型PCV2的Cap蛋白基因表达序列，所述PCV2的Cap蛋白基因表达序列为编码SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，其特征在于，所述PCV2的Cap蛋白基因表达序列为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，其特征在于，所述插入的PCV2 Cap蛋白基因表达序列的3
’
端，还连接有猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6转录调控序列，该转录调控序列为SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。4.一种核酸分子，其特征在于，包含连接有转录调控序列的PCV2 Cap蛋白基因表达序列，该PCV2 Cap蛋白基因表达序列为编码SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述转录调控序列与PCV2 Cap蛋白基因表达序列的3
’
端相连接，...

【专利技术属性】
技术研发人员：于海，童光志，严杰聪，虞凌雪，王帅勇，王娟，荣新利，刘清艳，高硕磊，陈荣琳，王曼茱，周艳君，单同领，童武，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：