一种构建表达IBDVVP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株的方法、该疫苗株和应用技术

本发明专利技术公开了一种构建表达IBDVVP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株的方法、该疫苗株和应用，属于医学或兽医学技术领域。所述的表达IBDVVP2基因的重组火鸡疱疹病毒是由含有HVT基因组DNA片段的重组粘粒H1、H2、H3、H5以及含有VP2表达框架的重组粘粒H4UL55

【技术实现步骤摘要】
一种构建表达IBDV VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株的方法、该疫苗株和应用


[0001]本专利技术涉及一种构建表达IBDV VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株的方法、还涉及由该方法构建得到的疫苗株和在制备鸡传染性法氏囊病疫苗中的应用。本专利技术属于医学或兽医学


技术介绍

[0002]鸡传染性法氏囊病(IBD)是由鸡传染性法囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的主要感染雏鸡的一种急性、高度接触性和免疫抑制性传染病。该病于1957年首发于美国甘布罗地区，又被称为“甘布罗病”。60多年来，该病一直威胁着养禽业的发展，世界动物卫生组织认为IBD已成为影响社会经济的重要疾病。抗原变异、免疫抑制，特别是超强毒株(vvIBDV)的出现，使得该病的防控形势更加严峻。IBDV基因组由两个双股RNA节段组成，分别为A节段和B节段。A节段编码的VP2蛋白构成病毒的外衣壳，是IBDV的主要结构蛋白。VP2可以诱导机体产生中和抗体，是IBDV主要的宿主保护性抗原。目前用于预防IBD的疫苗主要是传统活疫苗和灭活疫苗。弱毒活疫苗免疫效果易于受到母源抗体干扰，中毒力活疫苗副作用大，能够引起接种鸡法氏囊损伤和免疫抑制，影响其他疫苗免疫保护效果。全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗不适于早期免疫且免疫持续期短，需要多次加强免疫，造成养殖环节免疫负担过重。因此，研制安全性好、不受母源抗体干扰、免疫持续期长的新型基因工程疫苗对IBD的防控具有重要意义。
[0003]活载体疫苗诱导机体产生的免疫比较广泛，可以同时表达多种抗原，制成多价或多联疫苗，是当今和未来疫苗研发的主要方向之一。鸡马立克氏病是由马立克氏病病毒引起的一种鸡的传染性肿瘤病，以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征。该病是鸡的主要疾病之一，也是国内外50年代以来最受重视的鸡病。火鸡疱疹病毒(turkey herpes virus,HVT)在国内外被广泛用于鸡马立克氏病的防控。HVT作为一种疱疹病毒，具有基因组大、复制非必需区多且能容纳较大外源片段的优势，是研制活载体疫苗的理想载体。
[0004]本专利技术利用HVT多片段粘粒拯救系统和LR重组技术，将包含IBDV VP2基因以及CMV启动子的基因片段CMV
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VP2插入到HVT基因组的UL55和HVT066基因之间，构建获得在UL55和HVT066基因之间插入CMV
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VP2表达框架的重组粘粒，由其拯救获得了表达IBDV VP2基因的重组HVT疫苗株rHVTUL55
‑
VP2。将该重组疫苗株免疫无特定病原体(SPF)鸡能使SPF鸡产生良好的对抗IBDV的中和抗体，可以用于鸡传染性法氏囊病疫苗的制备。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种构建表达IBDV VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒疫苗株的方法、还涉及由该方法构建得到的疫苗株和在制备鸡传染性法氏囊病疫苗中的应用。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：
[0007]本专利技术的一种表达鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，
IBDV)VP2基因的重组火鸡疱疹(turkey herpes virus,HVT)病毒疫苗株，是由含有HVT基因组DNA片段的重组粘粒H1、H2、H3、H5以及含有VP2表达框架的重组粘粒H4UL55
‑
VP2共转染CEF细胞后，通过病毒拯救获得的；
[0008]其中，H1包含HVT
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FC126基因组1
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38663位的核苷酸片段、H2包含HVT
‑
FC126基因组36741
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75716位的核苷酸片段、H3包含HVT
‑
FC126基因组70814
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105354位的核苷酸片段、H5包含HVT
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FC126基因组131449
‑
159160位的核苷酸片段；
[0009]其中，H4UL55
‑
VP2是在重组粘粒H4的基础上，在HVT基因组UL55和HVT066基因之间插入VP2表达框架CMV
‑
VP2获得的重组粘粒，所述的重组粘粒H4包含HVT
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FC126基因组95062
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135217位的核苷酸片段。
[0010]其中，优选的，HVT
‑
FC126株基因组序列的GenBank登录号为AF291866。
[0011]其中，优选的，VP2的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0012]其中，优选的，所述的含有HVT基因组DNA片段的重组粘粒H1、H2、H3、H5是通过分别将HVT
‑
FC126基因组1
‑
38663位的核苷酸片段、HVT
‑
FC126基因组36741
‑
75716位的核苷酸片段、HVT
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FC126基因组95062
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135217位的核苷酸片段、HVT
‑
FC126基因组131449
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159160位的核苷酸片段与pCC1Fos载体连接后得到的。
[0013]其中，优选的，所述的含有VP2表达框架的重组粘粒H4UL55
‑
VP2是通过以下方法制备得到的：
[0014](1)表达VP2基因的重组质粒pCI
‑
VP2的构建
[0015]将VP2基因序列经EcoR1、KpnI酶切后，插入经同样酶切处理的pCI载体，获得表达VP2基因的重组质粒pCI
‑
VP2，VP2的基因序列如SEQ ID NO.1所示；
[0016](2)表达VP2基因的入门质粒pENTR
‑
VP2的构建
[0017]将pENTR
‑
gus质粒中的gus基因删除，替换为BglII
‑
SalI
‑
XbaI
‑
NotI
‑
EcoRI
‑
KpnI
‑
SmaI
‑
SacI
‑
HindIII
‑
BamHI十个酶切位点，获得入门载体pENTR1，将pCI
‑
VP2表达质粒用BglII和BamHI进行酶切，酶切产物回收后获得表达框架CMV
‑
VP2，将获得的表达框架通过BglII和BamHI酶切位点克隆入pENTR1入门载体，获得表达VP2基因的入门质粒pENTR
‑
VP2；
[0018](3)表达鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的重组粘粒的构建
[0019]以含有Kan
‑
ccdB表达框架的重组质粒pKS
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)VP2基因的重组火鸡疱疹(turkey herpes virus,HVT)病毒疫苗株，其特征在于，所述的表达鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病毒疫苗株是由含有HVT基因组DNA片段的重组粘粒H1、H2、H3、H5以及含有VP2表达框架的重组粘粒H4UL55
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VP2共转染CEF细胞后，通过病毒拯救获得的；其中，H1包含HVT
‑
FC126基因组1
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38663位的核苷酸片段、H2包含HVT
‑
FC126基因组36741
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75716位的核苷酸片段、H3包含HVT
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FC126基因组70814
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105354位的核苷酸片段、H5包含HVT
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FC126基因组131449
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159160位的核苷酸片段；其中，H4UL55
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VP2是在重组粘粒H4的基础上，在HVT基因组UL55和HVT066基因之间插入VP2表达框架CMV
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VP2获得的重组粘粒，所述的重组粘粒H4包含HVT
‑
FC126基因组95062
‑
135217位的核苷酸片段。2.如权利要求1所述的表达鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病毒疫苗株，其特征在于，HVT
‑
FC126株基因组序列的GenBank登录号为AF291866。3.如权利要求1所述的表达鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病毒疫苗株，其特征在于，VP2的基因序列如SEQ ID NO.1所示。4.如权利要求1所述的表达鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病毒疫苗株，其特征在于，所述的含有HVT基因组DNA片段的重组粘粒H1、H2、H3、H5是通过分别将HVT
‑
FC126基因组1
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38663位的核苷酸片段、HVT
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FC126基因组36741
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75716位的核苷酸片段、HVT
‑
FC126基因组70814
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105354位的核苷酸片段、HVT
‑
FC126基因组131449
‑
159160位的核苷酸片段与pCC1Fos载体连接后得到的。5.如权利要求1所述的表达鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病毒疫苗株，其特征在于，所述的含有VP2表达框架的重组粘粒H4UL55
‑
VP2是通过以下方法制备得到的：(1)表达VP2基因的重组质粒pCI
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VP2的构建将VP2基因序列经EcoR1、KpnI酶切后，插入经同样酶切处理的pCI载体，获得表达VP2基因的重组质粒pCI
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VP2，VP2的基因序列如SEQ ID NO.1所示；(2)表达VP2基因的入门质粒pENTR
‑
VP2的构建将pENTR
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gus质粒中的gus基因删除，替换为BglII
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SalI
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XbaI
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NotI
‑
EcoRI
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KpnI
‑
SmaI
‑
SacI
‑
HindIII
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BamHI十个酶切位点，获得入门载体pENTR1，将pCI
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VP2表达质粒用BglII和BamHI进行酶切，酶切产物回收后获得表达框架CMV
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VP2，将获得的表达框架通过BglII和BamHI酶切位点克隆入pENTR1入门载体，获得表达VP2基因的入门质粒pENTR
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VP2；(3)表达鸡传染性法氏囊病毒VP2基因的重组粘粒的构建以含有Kan
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ccdB表达框架的重组质粒pKS
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Kan/ccdB为模板，以H55KCF：5
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ATT TGT TTA ATG TTA GTT TAT TCA ATG CAT TGG TTG CAA ATA TTC ATT ACA TCA CAA GTT TGT ACA AAA AAG CTG
‑3’
和H55KCR：5
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TCC TGT AGT AATTTT CAC AGC AAT GTC ATA ACA TCA TCT CGC TAA AGA ATA TCA CCA CTT TGT ACA AGA AAG
‑3’
为引物PCR扩增获得带有HVT UL55和HVT066基因同源臂的Kan/ccdB表达框架；用Counter
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Selection BAC Modification Kit试剂盒将所扩增的片段克隆入含有HVT
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FC126株基因组95062
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135217位DNA片段的重组粘粒H4的HVT UL5...

【专利技术属性】
技术研发人员：王笑梅，李凯，高玉龙，刘长军，祁小乐，张艳萍，崔红玉，高立，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心，
类型：发明
国别省市：