一种基于蛋白质固有荧光非标记检测谷物中的黄曲霉毒素B1的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于蛋白质固有荧光非标记检测谷物中的黄曲霉毒素B1的方法，所述方法利用纳米金颗粒增强光子晶体微球表面人工抗原(黄曲霉毒素B1‑

【技术实现步骤摘要】
一种基于蛋白质固有荧光非标记检测谷物中的黄曲霉毒素B1的方法


[0001]本专利技术属于黄曲霉毒素B1检测，具体涉及一种基于蛋白质固有荧光非标记检测谷物中的黄曲霉毒素B1的方法。

技术介绍

[0002]黄曲霉毒素(Aflatoxins，AFs)是一类危害严重、理化性质稳定的强致癌性真菌毒素，在国内外一直都备受关注。它主要通过膳食渠道进入人和动物体内，过量摄入可导致肝癌发生。除此之外黄曲霉毒素还会引起生长障碍(如发育迟缓、身形消瘦等)。国际癌症研究机构(IARC)将黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)以及黄曲霉毒素(AFG2)列为Ⅰ类致癌物。另外，AFB1相对分子量为312.27，对光、热非常稳定，只有加热到280— 300℃才裂解，高压灭菌2小时，毒力降低25％—33％，4小时降低50％。一旦 AFB1污染食品或中药链，将会造成巨大损失。目前，防止AFB1污染食品或中药链的最有效的方法是开发高效、灵敏、低成本的快速检测方法。
[0003]目前样品中AFB1的检测方法有薄层色谱方法、高效液相色谱方法、高效液相色谱
‑
质谱方法，免疫试纸条方法、拉曼光谱等方法。薄层色谱方法检测灵敏度受到限制，色谱仪器方法需要昂贵的设备，熟练操作仪器的工作人员，前处理过程复杂，需要免疫亲和柱富集纯化，有时还需要衍生化，检测时间长，成本高，不适合现场在线快速检测。免疫试纸条方法、拉曼光谱等快速方法虽然可以现场在线快速检测AFB1，但是，这些方法多数只能半定量检测。因此，开发一种特异性高、成本低、操作简单的AFB1是非常必要的。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：针对现有技术中检测黄曲霉毒素B1方法中存在的问题，本专利技术提供了一种基于蛋白质固有荧光非标记检测谷物中的黄曲霉毒素B1的方法，本专利技术能够灵敏的、特异性的检测样品中的黄曲霉毒素B1，降低检测成本。
[0005]技术方案：为了实现上述目的，本专利技术一种基于蛋白质固有荧光非标记检测谷物中的黄曲霉毒素B1的方法，包括如下步骤：
[0006]在纳米金颗粒表面固定黄曲霉毒素B1单克隆抗体，在光子晶体微球表面固定人工抗原黄曲霉毒素B1‑
BSA，当黄曲霉毒素B1标准品或样品提取液与上述纳米金颗粒及光子晶体微球一起孵育后，检测光子晶体微球的荧光信号，根据微球的荧光信号进行定性定量检测样品中黄曲霉毒素B1。
[0007]其中，所述方法利用表面固定黄曲霉毒素B1单克隆抗体的纳米金颗粒增强光子晶体微球表面人工抗原黄曲霉毒素B1‑
BSA固有荧光实现检测。
[0008]其中，所述光子晶体微球通过二氧化硅乳液和甲基硅油自组装形成，所述二氧化硅乳液由TEOS和氨水制成。
[0009]其中，所述光子晶体微球表面固定人工抗原黄曲霉毒素B1‑
BSA由光子晶体微球修
饰羟基和环氧基后，加入AFB1‑
BSA，震荡反应得到。
[0010]作为优选，所述二氧化硅纳米粒子的粒径为320nm,光子晶体微球用微流控自组装制备，其大小为270μm，取光子晶体微球置于离心管中，将浓硫酸和双氧水配置成食人鱼溶液，将食人鱼溶液加入装有光子晶体微球的离心管中，置于脱色摇床中，室温下震荡反应。反应结束后，用双蒸水洗去微球表面多余的食人鱼溶液，置于鼓风干燥箱中烘至水分完全蒸发。用甲苯溶液配置二乙氧基甲基[(3
‑ꢀ
环氧乙烷基甲氧)丙基]硅烷(GPTMS)甲苯溶液，将不同浓度的GPTMS甲苯溶液分别加入装有羟基化的光子晶体微球的离心管中，置于震荡培养箱中，震荡反应，反应结束后先后用甲苯、无水乙醇、双蒸水洗涤，清洗完毕后置于鼓风干燥箱中烘至水分完全蒸发，收集待用；将AFB1‑
BSA,溶液加入到上述收集微球中，震荡反应，洗涤，用BSA封闭，再洗涤得到光子晶体微球表面固定人工抗原黄曲霉毒素B1‑
BSA。
[0011]其中，所述纳米金颗粒由柠檬酸三钠还原氯金酸形成。
[0012]其中，所述纳米金颗粒表面固定黄曲霉毒素B1单克隆抗体由柠檬酸三钠还原氯金酸形成的胶体金溶液，加入巯基
‑
聚乙二醇
‑
羧基溶液和甲氧基
‑
聚乙二醇
‑ꢀ
巯基溶液进行修饰，再进行活化，加入单克隆抗体AFB1‑
ab，震荡反应得到。
[0013]作为优选，纳米颗粒粒径为巯基
‑
聚乙二醇
‑
羧基加入纳米颗粒溶液中搅拌后加入甲氧基
‑
聚乙二醇
‑
巯基搅拌。混合物离心去除多余的PEG之后加入 EDC和NHS溶液，置于脱色摇床中，室温下震荡反应，反应结束后使用PB缓冲液清洗以除去多余的EDC和NHS溶液，使用PB缓冲液将上述反应得到的胶体金溶液定容得到纳米金颗粒溶液。将单克隆抗体AFB1‑
ab加上述纳米金颗粒溶液中，震荡反应，离心后洗涤，悬浮纳米金颗粒得到纳米金颗粒表面固定黄曲霉毒素B1单克隆抗体。
[0014]其中，所述孵育为在35
‑
37℃孵育时间90
‑
100min。
[0015]作为优选，所述孵育为在37℃孵育时间90min。
[0016]其中，所述检测光子晶体微球的荧光信号为利用倒置荧光显微镜配置荧光光谱仪及CCD成像系统测定其荧光强度，记录结果并使用OriginPro9软件分析。
[0017]其中，所述检测为在40
×
目镜下聚焦，激发光波长在360
‑
370nm。
[0018]本专利技术利用纳米金颗粒增强光子晶体微球表面人工抗原(黄曲霉毒素B1
‑
牛血清蛋白)固有荧光的机理，在纳米金颗粒表面固定黄曲霉毒素B1单克隆抗体，在光子晶体微球表面固定有人工抗原黄曲霉毒素B1
‑
BSA，当黄曲霉毒素B1标准品或样品提取液与修饰有上述生物分子的纳米金颗粒及光子晶体微球一起孵育后，检测光子晶体微球的荧光信号，根据微球的荧光信号进行定性定量检测样品中黄曲霉毒素B1。本专利技术能够灵敏的、特异性的检测样品中的黄曲霉毒素B1，降低检测成本。本专利技术不需要标记，一步反应，简单、快速、灵敏、低成本检测黄曲霉毒素B1。
[0019]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下优点：
[0020](1)通过该方法检测AFB1毒素不需要荧光标记；
[0021](2)本专利技术方法仅仅需要一步孵育就可以检测结果，时间快速；
[0022](3)本专利技术每个样品仅仅需要2μL样品，试剂消耗少；
[0023](4)本专利技术检测AFB1毒素灵敏度达到pg/g；
[0024](5)和其他检测AFB1方法相比，检测成本低。
附图说明
[0025][0026]图1蛋白质固有荧光非标记检测谷物中的黄曲霉毒素B1技术路线图；
[0027]图2为纳米金颗粒形貌表征及紫外吸收光谱；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于蛋白质固有荧光非标记检测谷物中的黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，包括如下步骤：在纳米金颗粒表面固定黄曲霉毒素B1单克隆抗体，在光子晶体微球表面固定人工抗原黄曲霉毒素B1‑
BSA，当黄曲霉毒素B1标准品或样品提取液与上述纳米金颗粒及光子晶体微球一起孵育后，检测光子晶体微球的荧光信号，根据微球的荧光信号进行定性定量检测样品中黄曲霉毒素B1。2.根据权利要求1所述的基于蛋白质固有荧光非标记检测谷物中的黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述方法利用表面固定黄曲霉毒素B1单克隆抗体的纳米金颗粒增强光子晶体微球表面人工抗原黄曲霉毒素B1‑
BSA固有荧光实现检测。3.根据权利要求1所述的基于蛋白质固有荧光非标记检测谷物中的黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述光子晶体微球通过二氧化硅乳液和甲基硅油自组装形成，所述二氧化硅乳液由TEOS和氨水制成。4.根据权利要求1所述的基于蛋白质固有荧光非标记检测谷物中的黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述光子晶体微球表面固定人工抗原黄曲霉毒素B1‑
BSA由光子晶体微球修饰羟基和环氧基后，加入AFB1‑
BSA，震荡反应得到。5.根据权利要求1所述的基于蛋白质固有荧光非标记检测谷物中的黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述纳...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建林，代士杰，李前进，窦梦华，徐瑞敏，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：