【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种肿瘤检测及生物传感器技术，具体涉及一种细胞表面糖基化rna的酸响应成像方法。
技术介绍
1、2021年，斯坦福大学carolyn r.bertozzi(2022年诺贝尔化学奖获得者)团队首次在细胞表面发现糖基化rna。糖基化rna是以rna为支架，上面修饰聚糖。这一发现挑战了生物学传统观念：糖基化修饰过程只发生在蛋白质或脂肪(脂质)上，并发现可能与一些疾病有关，但具体机制仍待研究。最近，lu课题组利用arpla技术实现细胞表面糖基化rna的原位检测，并且发现糖基化rna在肿瘤细胞中的丰度比健康细胞中的丰度高，随着肿瘤细胞的生长发展丰度越来越低。这些研究表明糖基化rna参与生理病理过程，可以作为一种生物标志物指示疾病的发展进程，用于癌症诊断。然而，目前缺乏肿瘤细胞表面糖基化rna的特异性检测技术，对肿瘤表面的糖基化rna研究受到了限制，包括肿瘤细胞中rna的动态监测，生理病理作用机制等。
2、细胞成像是肿瘤诊断中重要的一环，相比于电化学、质谱法，不需要进行复杂的预处理，不会损坏细胞，便于直观的监测活细胞表面物质的信号，被广泛应用于生物传感器的构建中。
技术实现思路
1、专利技术目的：本专利技术的目的在于提出一种细胞表面糖基化rna的酸响应成像方法。本专利技术提出将适配体包括neu5ac(唾液酸适配体)和u1 rna适配体与酸响应i-motif序列结合，构建一种肿瘤细胞表面糖基化rna的荧光分析技术，实现方便、灵敏、准确的细胞成像。
2、技术方
3、所述的细胞表面糖基化rna的酸响应成像方法，所述唾液酸适配体的序列为：tagggaattcgtcgacggatcccgtggcgtctgcaacggaaaagaatttatcttgtcctgcaggtcgacgcatgcgccgccccccccccagaacctggactgcgtactatttaatagctc-rox；
4、u1 rna适配体的序列为：cy5-tctgtagcgaccgttccgcgtactggcttaaaaaaaaaaatatgaatggaccgtcccctctatggtactagtgcttccaccaaaagggtc；
5、i-motif序列：cagtacgcggaacggtcgctacagatttcccccctcccccctttacccccctcccccctttgagctattaaatagtacgca；
6、封闭链的序列为：ggtaaagcgggcaggtggg-bhq2。
7、所述的细胞表面糖基化rna的酸响应成像方法，操作步骤包括以下步骤：
8、(1)将唾液酸适配体、u1 rna适配体、i-motif、封闭链混合，退火，用ph＝7～8的缓冲溶液稀释得到dna传感器；
9、(2)将肿瘤细胞与封闭液进行孵育，封闭非特异性结合位点，随后将步骤(1)得到的dna传感器与封闭后的肿瘤细胞孵育，在激光共聚焦显微镜520-600nm激发波长检测，细胞表面仅有rox通道呈现荧光，表明dna传感器成功连到肿瘤细胞表面糖基化rna上；
10、(3)向步骤(2)已经连上dna传感器的肿瘤细胞中加入不同ph的缓冲溶液进行孵育，在520-600nm激发下，随着ph的减小，rox通道的荧光逐渐变弱，cy5通道的荧光逐渐变强。
11、所述的细胞表面糖基化rna的酸响应成像方法，步骤(3)中的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，主要成分为nah2po4、na2hpo4以及nacl。
12、所述的细胞表面糖基化rna的酸响应成像方法，封闭液包括牛血清蛋白、tris-hcl、mgcl2，ph＝7～8。优选的，封闭液由牛血清蛋白(bsa)、50mm tris-hcl、10mm mgcl2组成，ph＝7.4。
13、所述的细胞表面糖基化rna的酸响应成像方法，步骤(3)中在ph为5.0～7.4的范围，cy5通道荧光信号随ph的降低越明显，cy5/rox信号越来越强。
14、所述的细胞表面糖基化rna的酸响应成像方法，步骤(2)、(3)中的孵育温度为35～39℃，孵育时间为25～35min。
15、dna传感器，由唾液酸适配体、u1 rna适配体、i-motif序列、封闭链组成。优选的，唾液酸适配体与u1 rna适配体上各自修饰有不同的荧光基团，封闭链上修饰荧光猝灭基团。
16、试剂盒，包括唾液酸适配体、u1 rna适配体、i-motif序列、封闭链。优选的，唾液酸适配体与u1 rna适配体上各自修饰有不同的荧光基团，封闭链上修饰荧光猝灭基团。
17、所述的dna传感器或所述的试剂盒在制备肿瘤诊断试剂中的应用。优选的，所述的dna传感器或所述的试剂盒在制备乳腺癌诊断试剂中的应用。
18、所述唾液酸适配体3’端修饰荧光基团rox，u1 rna适配体5’端的修饰荧光基团cy5，封闭链3’端修饰猝灭基团bhq2。
19、所述的细胞表面糖基化rna的酸响应成像方法，操作步骤如下：
20、(1)将唾液酸适配体、u1 rna适配体、i-motif、封闭链按照摩尔比1:1:1:1混合进行退火，用ph＝7.4的1×pbs缓冲溶液稀释得到400nmdna传感器。
21、(2)将肿瘤细胞与封闭液进行孵育，封闭非特异性结合位点，随后将步骤(1)得到的dna传感器与封闭后的肿瘤细胞孵育。在激光共聚焦显微镜激发波长561nm检测，细胞表面仅有rox通道呈现荧光，表明dna传感器成功连到肿瘤细胞表面糖基化rna上。
22、(3)向步骤(2)已经连上dna传感器的肿瘤细胞中加入不同ph的1×pbs缓冲溶液进行孵育。在561nm激发下，随着ph的减小，rox通道的荧光逐渐变弱，cy5通道的荧光逐渐变强。
23、所述步骤(1)中退火程序为95℃,10min+92.5℃,2min+90.0℃,2min+87.5℃,2min+85.0℃,2min+82.5℃,2min+80.0℃,2min+77.5℃,2min+75.0℃,2min+72.5℃,2min+70.0℃,2min+67.5℃,2min+65.0℃,2min+62.5℃,2min+60.0℃,2min+57.5℃,2min+55.0℃,2min+52.5℃,2min+50.0℃,2min+47.5℃,2min+45.0℃,2min+42.5℃,2min+40.0℃,2min+37.5℃,2min+35.0℃,2min+32.5℃,2min本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种细胞表面糖基化RNA的酸响应成像方法，其特征在于，是由DNA传感器通过肿瘤细胞表面酸性微环境引发荧光变化检测肿瘤细胞表面糖基化RNA，其中所述DNA传感器含有四条链，包括唾液酸适配体、U1 RNA适配体、I-motif序列、封闭链，且唾液酸适配体与U1RNA适配体上各自修饰有不同的荧光基团，封闭链上修饰荧光猝灭基团。
2.根据权利要求1所述的细胞表面糖基化RNA的酸响应成像方法，其特征在于，所述唾液酸适配体的序列为：TAGGGAATTCGTCGACGGATCCCGTGGCGTCTGCAAC GGAAAAGAATTTATCTTGTCCTGCAGGTCGACGCATGCGCCGCCCCCCCCCCAGA ACCTGGACTGCGTACTATTTAATAGCTC-Rox；
3.根据权利要求1所述的细胞表面糖基化RNA的酸响应成像方法，其特征在于，操作步骤包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的细胞表面糖基化RNA的酸响应成像方法，其特征在于，步骤(3)中的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，主要成分为NaH2PO4、Na2HPO4以及NaCl。
...【技术特征摘要】
1.一种细胞表面糖基化rna的酸响应成像方法，其特征在于，是由dna传感器通过肿瘤细胞表面酸性微环境引发荧光变化检测肿瘤细胞表面糖基化rna，其中所述dna传感器含有四条链，包括唾液酸适配体、u1 rna适配体、i-motif序列、封闭链，且唾液酸适配体与u1rna适配体上各自修饰有不同的荧光基团，封闭链上修饰荧光猝灭基团。
2.根据权利要求1所述的细胞表面糖基化rna的酸响应成像方法，其特征在于，所述唾液酸适配体的序列为：tagggaattcgtcgacggatcccgtggcgtctgcaac ggaaaagaatttatcttgtcctgcaggtcgacgcatgcgccgccccccccccaga acctggactgcgtactatttaatagctc-rox；
3.根据权利要求1所述的细胞表面糖基化rna的酸响应成像方法，其特征在于，操作步骤包括以下步骤：
4.根据权利要求1所述的细胞表面糖基化rna的酸响应成像方法，其特征在于，步骤(3)中的缓冲溶...
【专利技术属性】
技术研发人员：张幸，李昺之，刘思锐，曹敏，赵芙蓉，戚金芝，王鑫斌，黄和，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：
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