一种HPLC-MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法技术

本发明专利技术涉及一种HPLC

【技术实现步骤摘要】
一种HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法


[0001]本专利技术属于生物分析领域，具体涉及一种HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法。

技术介绍

[0002]癫痫是一种常见的、复杂的神经系统疾病，是神经元高度同步化放电所致反复痫性发作的慢性疾病。癫痫的主要临床表现为发作性感觉、运动、行为及自主神经等出现不同程度的障碍，严重威胁人类的健康及患者的生活质量。癫痫是神经科仅次于头痛的第二大常见病，全世界癫痫患者约5000万，我国的癫痫患者已超过900万，而且有逐年递增趋势，目前对于新诊断的癫痫患者，药物治疗仍是首选，尽管有30％左右的患者经过抗癫痫药物(AEDs)治疗后疗效欠佳，但仍有70％左右的患者通过药物治疗痫性发作可以得到良好控制。
[0003]吡仑帕奈是世界首例AMPA受体拮抗剂，通过抑制突触后AMPA受体谷氨酸活性，减少神经元过度兴奋。吡仑帕奈片于2012年在欧洲、美国批准上市，于2019年在中国批准上市，用于成人和12岁及以上儿童癫痫部分性发作患者(伴或不伴继发性全面性癫痫发作)的加用治疗。
[0004]现有文献报道中使用HPLC
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UV、HPLC
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FL、HPLC
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UV/FL以及LC/MS/MS等方法对血浆中吡仑帕奈进行检测。但是，通常存在着前处理复杂、耗时，血浆用量大，分析时间长及定量下限高等缺点。例如，国外文献High
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performance liquid chromatography
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tandem mass spectrometry method for the determination of perampanel,a novel
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amino
‑3‑
hydroxy
‑5‑
methyl
‑4‑
isoxazolepropionic acid receptor antagonist in human plasma报道使用LC/MS/MS检测人血浆中吡仑帕奈的方法：流动相：水
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乙酸
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200mM醋酸铵(100:0.1:0.1，v/v/v)和乙腈
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乙酸
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200mM醋酸铵(100:0.1:0.1，v/v/v)；流速0.2ml/min；色谱柱：YMC
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Pack Pro C8TM(50mm
×
3.0mm)。处理步骤：取用100μL血浆，加入10μL内标工作液，再加入4mL叔丁基甲基醚液液萃取，涡旋5min混匀，在4℃和710g下离心10min，有机层氮气吹干，500μL乙腈
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水
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乙酸
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200mm醋酸铵(70:30:0.1:0.1，v/v/v/v)复溶，10μL进样分析，该方法采用液液萃取，操作步骤繁杂，需氮吹复溶，前处理十分耗时。但是该方法分析物提取回收率为86.3
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90.5％，内标提取回收率为92.1％，提取回收率较差。国外文献Simple and rapid validated HPLC
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fluorescence determination of perampanel in the plasma of patients with epilepsy报道HPLC
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FL检测人血浆中吡仑帕奈的方法：色谱柱Kinetex PFP(100
×
2.6mm，4.6μm)；流动相0.03M乙酸钠pH 3.7和乙腈(40/60，v/v)；流速为0.8mL/min；样品制备取用250μL血浆，用乙腈蛋白沉淀。该方法虽然采用蛋白沉淀进行前处理，但血浆用量为250μL，血浆用量大，且该方法的定量下限为20ng，灵敏度较差；且该方法水相为0.03M乙酸钠pH 3.7，酸性环境对仪器的损害较大，对色谱柱耐用性要求高，不适合高通量的样品分析。
[0005]鉴于上述的缺陷，需开发更简单、可靠的样品预处理方法以及血浆药物浓度检测
的方法，用于人血浆中吡仑帕奈的测定。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是在现有技术的基础上，提供一种HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，具有前处理所需血浆量少、操作简单、重现性好、灵敏度高、分析速度快、基质效应影响小，提取回收率高等优点。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]一种HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，它包括以下步骤：(1)人血浆样品前处理；(2)液相色谱
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质谱联用检测，采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，其中，流动相A为乙腈
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水混合溶液；流动相B为包含0.05～0.2％甲酸的3～7mM甲酸铵水溶液；(3)人血浆中左旋兰索拉唑和右旋兰索拉唑的测定；梯度洗脱过程如下：在0
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0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为55:45；在0.5
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2.3分钟内，流动相A和流动相B的体积比由55:45匀速渐变至75:25；在2.3
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3.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为75:25；在3.5
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4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由75:25匀速渐变至55:45；在4.0
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4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为55:45；具体的梯度洗脱过程如表1：
[0009]表1吡仑帕奈液相色谱梯度
[0010][0011][0012]本专利技术在测定人血浆中吡仑帕奈时，采用梯度洗脱的方式进行分析，分析时间仅为4.5min，分析的时间短，大大缩短了分析时间；采用API 4000的质谱可以达到2.00ng/mL的定量下限，降低了对仪器的要求，使大批量生物样本分析更加方便、可行。
[0013]本专利技术采用HPLC/MS
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MS联用检测人血浆中吡仑帕奈时，流动相A为乙腈
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水混合溶液，在一种优选方案中，在梯度洗脱过程中，流动相A中乙腈
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水的体积比90～98:10～12，可以但不局限于90:10、91:9、92:8、93:7、94:6、95:5、96:4、97:3或98:2，为了取得更好的分离效果，流动相A中乙腈
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水的体积比为95:5。
[0014]为了改善色谱分离选择性，本专利技术选择在甲酸铵水溶液中添加少量甲酸。例如，流动相B为包含0.05～0.2％甲酸的3～7mM甲酸铵水溶液，其中，0.05～0.2％甲酸的3～7mM甲酸铵水溶液是指以浓度为3～7mM甲酸铵水溶液的总体积为100％为基准，含有体积比为0.05～0.2％甲酸。对于本专利技术而言，在流动相B中，甲酸铵水溶液中甲酸铵的浓度可以但不局限于3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，其特征在于，它包括以下步骤：(1)人血浆样品前处理；(2)液相色谱
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质谱联用检测，采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为乙腈
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水混合溶液；所述流动相B为包含0.05～0.2％甲酸的3～7mM甲酸铵水溶液；(3)人血浆中吡仑帕奈的测定；所述梯度洗脱过程如下：在0
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0.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为55:45；在0.5
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2.3分钟内，流动相A和流动相B的体积比由55:45匀速渐变至75:25；在2.3
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3.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为75:25；在3.5
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4.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由75:25匀速渐变至55:45；在4.0
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4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比为55:45。2.根据权利要求1所述的HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，其特征在于，色谱条件包括：色谱柱采用ZORBAX Eclipse XDB
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Phenyl；优选地，色谱柱的长度为75mm，直径为4.6mm，填料粒径为3.5μm；柱温为35～45℃，优选为40℃；流速为0.5～1.0mL/min，优选为0.9mL/min。3.根据权利要求2所述的HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，其特征在于，所述流动相A为乙腈
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水混合溶液，在所述混合溶液中乙腈与水的体积比为90～98:10～12，优选地，在混合溶液中乙腈与水的体积比为95:5；所述流动相B为包含0.1～0.15％甲酸的4～6mM甲酸铵水溶液，优选地，所述流动相B为包含0.1％甲酸的5mM甲酸铵水溶液。4.根据权利要求1所述的HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的方法，其特征在于，在步骤(1)中，人血浆样品通过蛋白沉淀法进行前处理；采用吡仑帕奈
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d5作为内标，采用乙腈作为沉淀剂。5.根据权利要求4所述的HPLC
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MS/MS联用检测人血浆中吡仑帕奈的...

【专利技术属性】
技术研发人员：高盼，高倩倩，李艳静，
申请(专利权)人：南京海纳制药有限公司南京一诺医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：