一种金黄色葡萄球菌疫苗的生产方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种金黄色葡萄球菌疫苗的生产方法及应用。本发明专利技术提供了一种金黄色葡萄球菌疫苗的生产方法，包括以下步骤：1)将金黄色葡萄球菌菌株制成种子液；2)将所述种子液进行发酵；3)将发酵后的菌液进行离心以收集菌体，将所述菌体用生理盐水重悬调整浓度并用射线辐照灭活；4)将辐照后的菌液再用所述生理盐水调整浓度得到所述金黄色葡萄球菌疫苗。本制备方法操作便利，质量稳定可控，适用于工业化生产。产。产。

【技术实现步骤摘要】
一种金黄色葡萄球菌疫苗的生产方法及应用


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌疫苗的生产方法及应用。

技术介绍

[0002]金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是一种重要的条件致病菌。在成年群体中，大约有20％的人持续携带金葡菌，另有30％的人间歇性携带。金葡菌可引起皮肤和软组织感染，还可导致威胁生命的肺炎、菌血症及包括心内膜炎、脓毒性关节炎、骨髓炎等在内的严重并发症。金葡菌的外毒素还可以引起食物中毒、表皮松弛征和中毒性休克综合征。
[0003]感染金黄色葡萄球菌，通常可选用红霉素、青霉素、庆大霉素、万古霉素或先锋霉素VI治疗，但由于抗生素的滥用，出现多种耐受抗生素的新菌株，特别是耐甲氧西林菌株(Methicillin
‑
resistant S.aureus,MRSA)的迅速蔓延使得单纯依靠抗生素治疗金黄色葡萄球菌引发的相关疾病变得越来越不可靠。MRSA导致的感染用抗生素疗法很难治愈且致死率高。因此，针对金葡菌疫苗和免疫治疗的研究现已广泛开展。
[0004]金黄色葡萄球菌疫苗包括全菌灭活疫苗、基因工程疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗等。现有金黄色葡萄球菌疫苗的制备方法包括：1)提取金黄色葡萄球菌的一个或多个组份作为抗原来制备，主要采用原核表达金葡菌的一种或多种抗原，并利用佐剂吸附后制成疫苗；2)提取并纯化金葡菌的荚膜多糖，并加入表达的一种或多种金葡菌抗原蛋白，或者其它外源载体蛋白以提高其免疫原性；3)表达并纯化金葡菌分泌的一种或多种外毒素作为抗原，与载体蛋白结合以增强其免疫原性；4)将金葡菌的一种或多种蛋白抗原决定簇编码序列插入质粒，构建金葡菌DNA疫苗。以上列举的方法制备得到的疫苗的免疫原性均不如全菌体疫苗，未涵盖大部分毒性蛋白、保守抗原、保护性抗原、荚膜多糖等，因此存在覆盖性不够，适用范围窄等问题。而全菌体灭活疫苗可以克服这些问题，并刺激机体产生大量的免疫球蛋白。因此亟待研究一种免疫性和覆盖性提高，适用范围更广的金黄色葡萄球菌疫苗，可以补充和弥补现有技术的不足。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种工业化生产金黄色葡萄球菌疫苗的方法，以及所述疫苗的应用。
[0006]一种金黄色葡萄球菌疫苗的生产方法，包括以下步骤：
[0007]1)将金黄色葡萄球菌菌株制成种子液；
[0008]2)将所述种子液进行发酵；
[0009]3)将发酵后的菌液进行离心以收集菌体，将所述菌体用生理盐水重悬调整浓度并用射线辐照灭活；
[0010]4)将辐照后的菌液再用所述生理盐水调整浓度得到所述金黄色葡萄球菌疫苗。
[0011]进一步，步骤1)包括以下步骤：
[0012]a.将所述金黄色葡萄球菌菌株接种到TSA平板培养，得到一级种子；
[0013]b.将所述一级种子接种到TSB培养基中继续逐级扩大培养，扩大次数不少于2次，每次扩大培养时接种的菌浓度为0.01
‑
0.1OD/ml，接种的体积不超过培养体积的10％，培养的每级种子液的终浓度为0.8
±
0.2OD/ml。
[0014]进一步，所述步骤1)的具体操作步骤为：a.将所述金黄色葡萄球菌菌株接种到TSA平板培养，得到一级种子；b.将所述一级种子接种到TSB培养基中，调整菌浓度为0.01
‑
0.1OD/ml，然后扩大培养至对数生长期，得到二级种子液；c.再将所述二级种子液接种到新鲜TSB培养基中，调整菌浓度为0.01
‑
0.1OD/ml，继续扩大培养至对数生长期，得到三级种子液。在实际操作中，可根据最终工艺放大要求调整各步放大的体积(例如，理论上从100ml到1000ml，从1000ml到10L)。从原始菌株开始计算通常放大3次(即，一级种子、二级种子、三级种子)，放大次数不能太多(次数太多污染风险增大，1、2次太少延展性不够)。
[0015]进一步，所述金黄色葡萄球菌菌株包括ATCC25923、ATCC33591、SCPH
‑
18或SCPH
‑
25。
[0016]进一步，步骤2)中将所述种子液接种于含有1L
‑
20L发酵液的发酵罐内进行发酵，接种的菌浓度为0.01
‑
0.1OD/ml。实际的发酵体积一般为发酵罐体积的1/3
‑
1/2。作为一种优选，选择10L的发酵罐进行发酵。
[0017]进一步，发酵参数为：通气量3
‑
5L/min，转速200
‑
300rpm，温度35
‑
39℃，在线监测pH值和溶氧值，培养菌体至对数生长期(1.5
±
0.3OD/ml)。
[0018]进一步，步骤3)中所述离心的参数为2000
‑
4000
×
g室温离心10
‑
30min，离心完成后弃掉上清液收集菌体。
[0019]进一步，用所述生理盐水重悬收集的所述菌体，调整菌液浓度为0.5
‑1×
10
10
CFU/ml。
[0020]进一步，所述菌液用射线辐照灭活，灭活参数为：剂量率约5
‑
100Gy/min，总剂量约1500
‑
2500Gy。
[0021]进一步，所述射线为X射线、γ射线或同位素放射源Co
60
产生的射线。作为一种优选，所述射线为X射线。
[0022]进一步，步骤4)中用所述生理盐水调整辐照后的菌体使其终浓度为0.5
‑1×
108/ml。
[0023]上述任一项所述生产方法制备得到的金黄色葡萄球菌疫苗。
[0024]进一步，所述疫苗为金黄色葡萄球菌全菌体疫苗。
[0025]进一步，所述疫苗还含有佐剂。
[0026]进一步，所述佐剂包括铝佐剂、MF59、AS01、AS04、CpG或ISA51。本专利技术所述的金黄色葡萄球菌疫苗可以制备成不含佐剂的类型，也可以根据需要制备成添加佐剂的类型。
[0027]进一步，所述疫苗的剂型为皮下注射制剂、肌肉注射制剂、口服制剂或鼻腔吸入制剂。
[0028]进一步，同未经射线辐照的金黄色葡萄球菌相比，所述金黄色葡萄球菌疫苗的胞外核酸提高约20％；2
‑
8℃存放4周后，与辐照完成时相比，所述金黄色葡萄球菌疫苗的胞外核酸提高5
‑
15倍。
[0029]上述任一项所述的金黄色葡萄球菌疫苗在制备预防或治疗金黄色葡萄球菌引起
的菌血症药物中的应用。
[0030]进一步，所述金黄色葡萄球菌疫苗的免疫程序包括：皮下接种0.2ml，接种3针，每针间隔2周。
[0031]进一步，所述金黄色葡萄球菌疫苗含有金黄色葡萄球菌全菌体1
×
107/针
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种金黄色葡萄球菌疫苗的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将金黄色葡萄球菌菌株制成种子液；2)将所述种子液进行发酵；3)将发酵后的菌液进行离心以收集菌体，将所述菌体用生理盐水重悬调整浓度并用射线辐照灭活；4)将辐照后的菌液再用所述生理盐水调整浓度得到所述金黄色葡萄球菌疫苗。2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤1)包括以下步骤：a.将所述金黄色葡萄球菌菌株接种到TSA平板培养，得到一级种子；b.将所述一级种子接种到TSB培养基中逐级扩大培养，扩大次数不少于2次，每次扩大培养时接种的菌浓度为0.01
‑
0.1OD/ml,接种体积不超过培养体积的10％，培养的每级种子液的终浓度为0.8
±
0.2OD/ml。3.如权利要求2所述的生产方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌菌株包括ATCC25923、ATCC33591、SCPH
‑
18或SCPH
‑
25。4.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤2)中将所述种子液...

【专利技术属性】
技术研发人员：王震玲，魏于全，
申请(专利权)人：成都威斯克生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：