铜绿假单胞菌疫苗的工业化生产方法技术

本发明专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌疫苗的工业化生产方法。本发明专利技术提供的一种工业化生产铜绿假单胞菌疫苗的方法，采用一系列标准化、程序化、数字化的设定，确保生产出一种质量稳定的含有铜绿假单胞菌全菌体和菌内多种免疫原性成分的疫苗。由本发明专利技术提供的方法制备得到的疫苗具备良好的免疫原性，可以预防多种铜绿假单胞菌引起的感染性疾病，同时副作用小，安全性高。安全性高。安全性高。

【技术实现步骤摘要】
铜绿假单胞菌疫苗的工业化生产方法


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌疫苗的工业化生产方法。

技术介绍

[0002]铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)，又称绿脓杆菌，是一种常见的条件致病菌，其对外界各种环境及灭活措施抵抗力较强，尤其在潮湿的环境中可长期生存。在土壤、水、空气、人和动物的皮肤、粘膜、肠道及上呼吸道等多处都有该菌存在，其致病特点是引起继发感染，多发生在机体抵抗力低下的病人中，如大面积烧伤、长期使用免疫抑制剂、肿瘤、低蛋白血症患者等。铜绿假单胞菌引起的感染可发生在人体任何部位，临床上常见的有皮肤和皮下组织感染，包括中耳炎、脑膜炎、呼吸道感染、尿道感染、败血症等。据近年的调查报告，医院院内感染中30％以上都是由铜绿假单胞菌引起的。目前对于铜绿假单胞菌引起的感染主要靠药物治疗，因此近年来抗生素的滥用导致大量耐药菌株的产生进而加剧了铜绿假单胞菌对患者的威胁。目前已经研究成熟的铜绿假单胞菌对抗生素的耐药机制包括以下几方面：
①
细菌外膜通透性降低，阻碍抗生素进入细菌内膜靶位；
②
铜绿假单胞菌细胞通过主动外排过程，可将范围极其广泛的结构不相关的抗生素或其他有毒物质排出细胞外；
③
改变抗生素的作用靶点青霉素结合蛋白(PBPs)的数量或结构，以降低药物与PBPs的亲和力，从而产生固有耐药；
④
质粒或染色体介导的β
‑
内酰胺酶使抗生素失活。所以目前铜绿假单胞菌的感染已经到了无抗生素可用的阶段，通过免疫方式预防及控制铜绿假单胞菌感染已是大势所趋。
[0003]疫苗是一种能刺激机体免疫系统，活化T和B淋巴细胞产生特异性针对靶抗原(病毒、细菌等)的抗体或者免疫细胞的物质。目前全世界研究的铜绿假单胞菌疫苗制备方式已经涉及多个技术层面，如热或者甲醛处理的死菌疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、单一组分(菌毛、鞭毛、外膜蛋白OprI/OprF等)疫苗等。在基础实验中，单一组分疫苗得了较好的预防效果，但由于抗原成分单一，只能针对单一的疾病(如肺炎等)的感染。灭活(热、甲醛等)或者减毒(基因突变)的全菌体疫苗抗病谱相对扩大，但由于制备过程某些未知抗原成分的灭活，细菌代谢活性降低，造成免疫原性及预防效果较差，且由于灭活不彻底，造成疫苗残留毒性较大。关于全菌体疫苗的研发已经在众多种属细菌(志贺菌，淋球菌，脑膜炎双球菌等)中实施，但这些疫苗绝大多数都已失败告终，因此制成有效的全菌体疫苗非常困难。此外，目前的铜绿假单胞菌全菌体疫苗的制备工艺仍以传统的甲醛灭活为主，甲醛已被WHO列为一类致癌物质，同时甲醛过敏体质不宜使用，急需采用新的灭活方法。
[0004]而现有技术公开的生产全菌体铜绿假单胞菌疫苗的方法仅适用于小批量生产，并不适用于大批量、工业化生产。基于此，本专利技术提供了一种工业化生产多组分和全菌体铜绿假单胞菌疫苗的方法，可以缓解现有问题中的一种或多种。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供一种铜绿假单胞菌疫苗的工业化生产方法，以及使用该方法制备得到
的铜绿假单胞菌疫苗，具体技术方案如下。
[0006]一种铜绿假单胞菌疫苗的工业化生产方法，包括如下步骤：
[0007]S1用适宜的培养基培养铜绿假单胞菌生产用菌株，制成种子液；培养基宜选用不含动物源成分的培养基，而不限于本专利技术实施例中所涉及的培养基。
[0008]S2将所述种子液按照发酵体积的2％～10％接种至发酵罐中进行发酵，其中发酵温度为30～40℃，pH值为5～9，转速为100～400rpm，通气量为2～5L/min，溶氧为10％～30％，发酵时间为3～8h；
[0009]S3监测所述发酵罐内的菌体密度，待所述发酵罐内的菌体密度达标后，取所述发酵罐内的菌液直接按照离心力3000～8000
×
g进行离心，10～30min后收集菌体；
[0010]S4将所述菌体用等渗注射液重悬并调整浓度，然后进行射线辐照使所述菌体失去增殖活性，所述射线辐照的射线包括X射线、γ射线和同位素放射源Co
60
产生的射线中的一种或多种，所述等渗注射液包括生理盐水等溶液；
[0011]S5取所述射线辐照后的菌液进行检查，所述菌液含有全菌体和菌内免疫原性成分，所述全菌体的占比大于80％为合格；
[0012]S6将所述步骤S5中检查合格的所述菌液再用所述等渗注射液重悬并调整浓度到1.0
×
107～3.0
×
107个/ml，制得一种铜绿假单胞菌疫苗。
[0013]进一步，所述发酵罐内的菌体密度的吸光值达到1～3OD为达标。
[0014]进一步，所述菌内免疫原性成分包括膜囊泡、核酸和菌体碎片。
[0015]进一步，所述步骤S4后进一步包括检定所述射线辐照后的菌液成分和含量的步骤，所述检定所述射线辐照后的菌液成分和含量的方法包括分光光度计法、密度梯度离心法、扫描电镜和透射电镜中的一种或多种。
[0016]进一步，所述射线辐照的基本灭活剂量不得低于1000Gy，所述射线辐照的总剂量大于所述射线辐照的基本灭活剂量。
[0017]进一步，所述射线辐照的方式为低剂量率，长时间，持续照射；所述剂量率优选为5～15Gy/min，所述持续照射的时间优选为大于2h。
[0018]进一步，确定所述射线辐照的灭活时间或灭活剂量的步骤包括：
[0019]a)确定装载辐照样品的容器的材质和形状，所述材质为医用级塑料材质，所述医用级塑料材质包括但不限于聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)等，所述形状优选为柱状、桶装或袋状；
[0020]b)确定灭活的最大装量；
[0021]c)确定菌液浓度：根据产量设计确定每批次灭活的总菌体量，再根据装量要求，选择合适的所述菌液浓度，所述菌液浓度的计算公式为：其中N表示菌液浓度，A表示产量人份，B表示每人份菌体剂量，V表示菌液总体积，V≤最大装量；
[0022]d)选择剂量率：设计不同剂量率组别，根据所述步骤a)～步骤c)进行所述最大装量的灭活，持续辐照时间设置为不低于2h，具体的，可设置为2h或大于等于2h的任意时间；
[0023]e)杀菌曲线的测定：根据步骤d)确定的所述剂量率和所述辐照时间，进行多批次辐照，并对中间时间点或延长时间点进行活菌计数，或者，对中间辐照剂量点或延长辐照剂
量点进行活菌计数，测定所述杀菌曲线；
[0024]6)确定灭活时间或灭活剂量：根据所述杀菌曲线，取相邻的第一时间点、第二时间点、第三时间点或者取相邻的第一辐照剂量点、第二辐照剂量点、第三辐照剂量点进行活菌计数，所述时间点间隔不小于20min，所述辐照剂量点间隔不小于200Gy，计数结果分别为小于100CFU/ml、0CFU/ml、0CFU/ml时，所述第二时间点为灭活时间，所述第二辐照剂量点为灭活剂量。
[0025]进一步优化，初步确定灭活时间或灭活剂量后，进一步优化的关键参数包括剂量率、辐照时本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种铜绿假单胞菌疫苗的工业化生产方法，其特征在于，包括如下步骤：S1用适宜的培养基培养铜绿假单胞菌生产用菌株，制成种子液；S2将所述种子液按照发酵体积的2％～10％接种至发酵罐中进行发酵，其中发酵温度为30～40℃，pH值为5～9，转速为100～400rpm，通气量为2～5L/min，溶氧为10％～30％，发酵时间为3～8h；S3监测所述发酵罐内的菌体密度，待所述发酵罐内的菌体密度达标后，取所述发酵罐内的菌液直接按照离心力3000～8000
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g进行离心，10～30min后收集菌体；S4将所述菌体用等渗注射液重悬并调整浓度，然后进行射线辐照使所述菌体失去增殖活性，所述射线辐照的射线包括X射线、γ射线和同位素放射源Co
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产生的射线中的一种或多种；S5取所述射线辐照后的菌液进行检查，所述菌液含有全菌体和菌内免疫原性成分，所述全菌体的占比大于80％为合格；S6将所述步骤S5中检查合格的所述菌液再用所述等渗注射液重悬并调整浓度到1.0
×
107～3.0
×
107个/ml，制得所述铜绿假单胞菌疫苗。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵罐内的菌体密度的吸光值达到1～3OD为达标。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌内免疫原性成分包括膜囊泡、核酸和菌体碎片。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S4后进一步包括检定所述射线辐照后的菌液成分和含量的步骤，所述检定所述射线辐照后的菌液成分和含量的方法包括分光光度计法、密度梯度离心法、扫描电镜和透射电镜中的一种或多种。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述射线辐照的基本灭活剂量不得低于1000Gy，所述射线辐照的总剂量大于所述射线辐照的基本灭活剂量。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述射线辐照的方式为低剂量率，长时间，持续照射；所述剂量率...

【专利技术属性】
技术研发人员：王震玲，魏于全，
申请(专利权)人：成都威斯克生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：