本发明专利技术属生物技术领域，涉及细菌毒素疫苗，具体涉及一种高负载细菌成孔毒素的脂质体疫苗及其用途，该纳米疫苗通过将细菌成孔毒素嵌入脂质体表面完成毒素的高效负载，不仅消除毒素的毒性作用，同时完整保留抗原蛋白结构，而且接种后可引起免疫细胞对成孔毒素的高效提呈并产生高滴度的特异性抗体，有效预防细菌感染尤其耐药细菌感染。感染尤其耐药细菌感染。
【技术实现步骤摘要】
一种细菌毒素疫苗及其在预防细菌感染中的用途
[0001]本专利技术属生物
，涉及细菌毒素疫苗，具体涉及一种负载细菌成孔毒素的脂质体疫苗及其用途，该脂质体疫苗通过将细菌成孔毒素嵌入人工脂质体双层膜上完成毒素的负载，不仅消除毒素的毒性作用，具有很高的安全性，而且接种后产生高效免疫反应，有效预防细菌感染尤其是耐药细菌感染。
技术介绍
[0002]据报道，细菌感染仍然是世界范围内的一类高发病率和高致死率的疾病，而耐药细菌尤其“超级细菌”的出现给抗细菌感染治疗带来了更大的挑战，严重威胁着人类的健康。目前全球新型抗生素研发匮乏，也缺乏针对“超级细菌”的疫苗上市，因此，亟需设计和开发新型药物改善耐药细菌感染的预防和治疗效果。
[0003]研究显示，细菌感染过程中，其释放的毒力因子(如外毒素、内毒素)能协助细菌的定殖、生长和传播，并且对宿主机体有较大的毒性作用，严重情况下可造成器官衰竭和死亡，因此，中和细菌毒素能够抑制细菌的存活与繁殖，同时避免其对宿主组织的直接破坏，而且不易产生耐药现象。近年来，抗细菌毒素策略逐渐成为耐药细菌感染治疗的研究热点之一。
[0004]抗毒素疫苗将抗毒素策略与疫苗治疗进行结合，能有效抵抗细菌感染，尽可能地减少细菌耐药现象的产生，如临床常采用的破伤风和白喉疫苗是抗毒素疫苗的典型成功案例。
[0005]传统的抗毒素疫苗(类毒素疫苗)的制备方法包括化学灭活和热灭活毒素，通过变性蛋白的方法来减少毒素抗原的毒性，其存在的主要问题是难以同时保证灭活毒素的安全性和免疫原性。实践显示，灭活毒素的安全性提高的同时往往导致免疫原性大幅度下降，免疫效果较差。成孔毒素(或称成孔蛋白)是细菌产生的最主要的毒力因子，具有很强的毒性，采用传统的制备方法虽然能降低其毒性，但其免疫原性和免疫效果很差，不具有抗毒素疫苗的价值。
[0006]近年来，随着成孔毒素结构和穿孔机制的研究，其与细胞膜的相互作用机制逐步得到阐明，研究表明，细胞的脂质膜结构是成孔毒素形成孔道的物质基础。受此启发，加州大学张良方课题组制备了红细胞膜包被聚合物纳米粒(也称为纳米海绵)用于成孔毒素的高亲和性吸附，并且将吸附了毒素的纳米海绵进一步开发为纳米类毒素疫苗。这种新型纳米类毒素疫苗不仅消除了毒素毒性，而且完整保留了毒素的蛋白质结构，实验结果显示，与传统热灭活疫苗比较，该纳米类毒素疫苗更安全，免疫激活能力更强。但该纳米类毒素疫苗仍存在一些明显不足，如对毒素负载量较低(以α溶血素为例，仅为22μg/mg)，抗原提呈效果较弱，免疫激活能力尚有待提高，而且细胞膜包被纳米粒的过程较为复杂，红细胞膜的活性难以保持，红细胞的资源有限，规模化生产困难，临床转化受到很大的限制。
[0007]基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供一种新型的高负载成孔毒素的纳米类毒素疫苗—脂质体类毒素疫苗。该纳米疫苗采用高胆固醇脂质体吸附细菌成孔毒素完成
毒素的高效负载，不仅消除毒素的毒性作用，同时完整保留抗原蛋白结构，接种后能促进免疫细胞对成孔毒素的高效提呈并产生高滴度的特异性抗体，实现有效预防细菌感染尤其是耐药细菌感染的目的。
技术实现思路
[0008]本专利技术目的在于基于现有技术的现状，提供一种新型高效的脂质体类毒素疫苗，尤其涉及脂质材料和成孔毒素组合物及其用途。该脂质体疫苗能避免传统灭活方法对毒素结构可能造成的破坏，且具有高的抗原载量；皮下免疫接种后，可促进免疫细胞对成孔毒素的高效提呈并产生高滴度的特异性抗体，中和毒素，预防细菌感染。
[0009]本专利技术中，首先制备高胆固醇脂质体，再与成孔毒素孵育，通过脂质体上脂阀与成孔毒素的相互作用高效吸附成孔毒素，制备成高负载成孔毒素的脂质体疫苗。通过体内外实验分析其安全性，考察其抗原提呈效果及免疫激活能力，最后对其预防毒素侵害和耐药细菌感染的效果进行评价，结果显示，由于该纳米疫苗主要由人工脂质体和毒素构成，不涉及生物膜资源的使用，该纳米疫苗采用高胆固醇脂质体吸附细菌成孔毒素完成毒素的高效负载，不仅消除毒素的毒性作用，同时完整保留抗原蛋白结构，接种后能促进免疫细胞对成孔毒素的高效提呈并产生高滴度的特异性抗体，实现有效预防细菌感染尤其是耐药细菌感染的目的，且制备生产方法简单易行，具有临床转化前景。
[0010]本专利技术进一步提供了一种使用脂质体疫苗引发受试者对插入脂质体膜的毒素的免疫应答的方法，和使用脂质体疫苗用于保护受试者不受成孔毒素影响的方法。在本专利技术的实施例中，免疫应答是B细胞介导的免疫应答。
[0011]本专利技术还提供了有效量的脂质体用于制造脂质体疫苗的用途，和有效量的载毒素脂质体用于制造保护受试者不受成孔毒素影响的疫苗的用途。
[0012]本专利技术能治疗、预防与成孔毒素相关的疾病或病症，包括但不限于：细菌感染，传染病，寄生虫病，中毒，肿瘤。
[0013]本专利技术进一步提供了一种包含本专利技术的脂质体疫苗的药物组合物。在本专利技术的实施例中，所述的药物组合物进一步包含一种或多种免疫佐剂或免疫增强剂和/或药学上可接受的载体或赋形剂，其可以与本专利技术的脂质体疫苗一起或组合施用。
[0014]本专利技术进一步提供了一种用于使用本专利技术的脂质体疫苗在有需要的受试者中治疗和/或预防疾病或病状的方法。在某些实施例中，经由任何适合的施用途径施用脂质体疫苗或其药物组合物。例如，可以经由经鼻腔、口腔黏膜、口服、肺吸入、静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、或皮内途径施用脂质体疫苗或其药物组合物。
[0015]本专利技术中，脂质体疫苗包括人工脂质体和细菌成孔毒素，其中，脂质体由胆固醇、磷脂酰脂碱(简称磷脂)、聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE
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PEG)和/或鞘磷脂构成。胆固醇是脂质膜脂阀的重要组成部分，对脂质体吸附毒素的效果影响较大。因此，胆固醇是脂质体的重要组成部分，占总脂质的质量比为20％～50％，优选40％～50％。DSPE
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PEG对脂质体疫苗的稳定性有很重要的影响，其占总脂质的质量比为5％～15％，优选10％。DSPE
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PEG中聚乙二醇分子量为1000～3000道尔顿，优选2000道尔顿。为了增强脂质体对毒素的吸附作用，脂质体可加入适量鞘磷脂，鞘磷脂和磷脂的质量和占总脂质质量比为35～75％。脂质体的粒径对毒素的吸附效果有一定的影响，其尺寸在80～1000nm，优选100～200nm。成孔毒
素可以是细菌(例如，金黄色葡萄球菌(S.aureus))、植物、真菌或动物毒素。在本专利技术中，脂质体和成孔毒素的质量比为100:3～100:15，优选100:10～100:15。
[0016]进一步，本专利技术通过以下技术方案实现脂质体疫苗研究：
[0017](1)薄膜分散法制备高胆固醇脂质体。再将细菌成孔毒素与脂质体孵育，制备脂质体疫苗。
[0018](2)对脂质体疫苗的理化性质进行表征。采用动态光散射法测定其粒径，电位，多分散系数。采用透射电镜观察其形态和大小。
[0019](3)对脂质体疫苗的安全性进行表征。采用溶血实验，体本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种细菌毒素疫苗，其特征在于，所述的细菌毒素疫苗为高负载成孔毒素的脂质体疫苗；所述的脂质体由胆固醇、磷脂酰胆碱、聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和/或鞘磷脂构成；所述的脂质膜和成孔毒素的质量比为100:3～100:15。2.按权利要求1所述的细菌毒素疫苗，其特征在于，所述的脂质膜和成孔毒素的质量比为100:10～100:15。3.按权利要求1所述的细菌毒素疫苗，其特征在于，所述的胆固醇占总脂质的质量比为20％～50％。4.按权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述的胆固醇占总脂质的质量比为40％～50％。5.按权利要求1所述的细菌毒素疫苗，其特征在于，所述的鞘磷脂和磷脂酰胆碱的质量和占总脂质的质量比为35％～75％。6.按权利要求1所述的细菌毒素疫苗，其特征在于，所述的聚乙...
【专利技术属性】
技术研发人员：庞志清，刘春影，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：
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