一种纳米类毒素疫苗及其用途制造技术

本发明专利技术属生物技术领域，涉及一种纳米类毒素疫苗及其用途，该纳米类毒素疫苗为高负载成孔毒素的红细胞膜融合脂质体，所述的红细胞膜融合脂质体由天然红细胞膜和人工脂质膜构成。本发明专利技术所述纳米类毒素疫苗通过将细菌成孔毒素嵌入纳米粒子表面完成毒素的高效负载，不仅消除毒素的毒性作用，同时完整保留抗原蛋白结构，而且接种后可引起免疫细胞对成孔毒素的高效提呈并产生高滴度的特异性抗体，有效预防细菌感染尤其耐药细菌感染。菌感染尤其耐药细菌感染。

【技术实现步骤摘要】
一种纳米类毒素疫苗及其用途


[0001]本专利技术属生物
，涉及纳米类毒素疫苗，具体涉及一种高负载细菌成孔毒素的 纳米类毒素疫苗及其用途，该纳米类毒素疫苗通过将成孔毒素嵌入纳米粒子表面完成毒素 的高效负载，不仅消除毒素的毒性作用，同时完整保留抗原蛋白结构，接种后可引起免疫 细胞对成孔毒素的高效提呈并产生高滴度的特异性抗体，有效预防细菌感染尤其是耐药细 菌感染。

技术介绍

[0002]据报道，细菌感染现仍然是世界范围内的一类高发病率和高致死率的疾病，而耐药细 菌尤其是“超级细菌”的出现给抗细菌感染治疗带来了更大的挑战，严重威胁着人类的健康 且带来极大社会经济负担，研究预测，截至2050年耐药细菌感染或导致全球上千万人死 亡，全球累计花费上百万亿美元。而目前全球新型抗生素研发停步不前，新型抗生素匮 乏，也没有任何针对“超级细菌”的疫苗上市。因此，亟需设计和开发新型的给药策略以改 善耐药细菌感染的预防和治疗效果。
[0003]研究显示，细菌感染过程中，其释放的毒力因子(如外毒素、内毒素)能辅助细菌的 定殖、生长和传播，并且对宿主机体有较大的毒性作用，严重情况下可造成器官衰竭和死 亡。因此，中和细菌毒素能够抑制细菌的存活与繁殖，同时避免其对宿主组织的直接破 坏。由于抗毒毒素治疗针对细菌分泌的毒力因子，不直接对细菌产生杀伤作用，因而不易 产生耐药现象。近年来，抗细菌毒素策略逐渐成为耐药细菌感染治疗的研究热点。
[0004]业内知悉，疫苗能帮助宿主的免疫系统识别病原体，为消除感染类疾病的最有效的公 共健康干预方法。机体产生的快速免疫反应能有效抵抗细菌感染，极大减少抗生素的使 用，因此疫苗也是减少耐药现象产生的重要工具。抗毒素疫苗是指将抗毒素策略与疫苗治 疗进行结合，能尽可能地减少细菌耐药现象的产生。临床常用的破伤风和白喉疫苗即是抗 毒素疫苗的成功案例。传统的抗毒素疫苗(类毒素疫苗)的制备方法包括化学灭活和热灭 活，通过变性蛋白的方法来减少毒素抗原的毒性。其存在的主要问题是难以同时保证灭活 毒素的安全性和免疫原性。灭活毒素的安全性提高的同时同免疫原性大幅度下降，免疫效 果较差。
[0005]成孔毒素也称为成孔蛋白，是细菌产生的最主要的毒力因子。近年来，随着成孔毒素 结构和穿孔机制的研究不断深入，其与细胞膜的相互作用机制逐步得到阐明。研究表明， 细胞的脂质膜结构是成孔毒素形成孔道的物质基础。受此启发，加州大学张良方等人制备 了红细胞膜包被聚合物纳米粒(也被称为纳米海绵)用于成孔毒素的高亲和性吸附，并且 将吸附了毒素的纳米海绵进一步开发为纳米类毒素疫苗。这种新型纳米类毒素疫苗不仅消 除了毒素毒性，而且完整保留了毒素的蛋白质结构，实验结果显示，与传统热灭活疫苗比 较，该纳米类毒素疫苗更安全，免疫激活能力更强(Hu,C.M.；Fang,R.H.；Luk,B.T.； Zhang,L.,Nanoparticle
‑
detained toxins for safe and effective vaccination.Nat Nanotechnol 2013,8(12),933
‑
8.)。但该纳米类毒素疫苗仍存在一些不足，如对毒素负载
量较低(以α 溶血素为例，仅为22μg/mg)，抗原提呈效果较弱，免疫激活能力尚有待提高，而且细胞 膜包被纳米粒的过程较为复杂，对红细胞膜的资源利用效率较低，难以大规模生产。
[0006]基于现有技术的现状，本专利技术拟构建一种新型的高负载成孔毒素的纳米类毒素疫苗— 红细胞膜融合脂质体类毒素疫苗。该纳米类毒素疫苗采用红细胞膜融合脂质体吸附细菌成 孔毒素完成毒素的高效负载，不仅消除毒素的毒性作用，同时完整保留抗原蛋白结构，接 种后可促进免疫细胞对成孔毒素的高效提呈并产生高滴度的特异性抗体，实现有效预防细 菌感染尤其是耐药细菌感染的目的。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的在于提供一种纳米类毒素疫苗，具体涉及红细胞膜，人工脂质材料和成孔 毒素的组合物及其用途；该纳米类毒素疫苗不仅避免了传统灭活方法对毒素结构可能造成 的破坏，而且具有很高的抗原载量(或表面抗原密度)。免疫接种后，可促进免疫细胞对 成孔毒素的高效提呈并产生高滴度的特异性抗体，中和毒素，预防细菌感染。
[0008]具体地，本专利技术首先将红细胞膜与PEG化的人工脂质膜进行融合，制得红细胞膜融 合脂质体，再与成孔毒素孵育，制备成高负载成孔毒素的类毒素疫苗。通过体内外实验分 析其安全性，考察其抗原提呈效果及免疫激活能力，最后对其预防毒素侵害和耐药细菌感 染的效果进行评价。结果显示，该纳米类毒素疫苗采用红细胞膜融合脂质体吸附细菌成孔 毒素完成毒素的高效负载，不仅消除毒素的毒性作用，同时完整保留抗原蛋白结构，接种 后可促进免疫细胞对成孔毒素的高效提呈并产生高滴度的特异性抗体，实现有效预防细菌 感染尤其是耐药细菌感染的目的。
[0009]本专利技术所述纳米类毒素疫苗为高负载成孔毒素的红细胞膜融合脂质体；
[0010]所述的红细胞膜融合脂质体由天然红细胞膜和人工脂质膜构成；
[0011]所述的天然红细胞膜的膜蛋白和人工脂质膜的质量比3:80～3:10，优选3:40～3:20；
[0012]所述的人工脂质膜由磷脂酰胆碱、聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，和/或胆固醇构 成；其中，
[0013]所述聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺其占人工脂质的质量比为5％～15％，优选 10％；
[0014]所述磷脂和胆固醇的质量和占总脂质的质量比为85％～95％，优选90％；
[0015]所述聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中聚乙二醇分子量为1000～3000道尔顿，优选 2000道尔顿；
[0016]所述红细胞膜融合脂质体的粒径在80～200nm，优选100～130nm；
[0017]本专利技术所述的人工脂质膜和成孔毒素的质量比为10:1～10:6，优选10:2～10:4。
[0018]所述的纳米类毒素疫苗可用于制备预防细菌感染药物。
[0019]本专利技术进一步提供了一种使用纳米类毒素疫苗引发受试者对成孔毒素免疫应答的方 法，和使用纳米类毒素疫苗保护受试者不受成孔毒素影响的方法。在本专利技术的实施例中， 免疫应答是B细胞介导的免疫应答。
[0020]本专利技术还提供了有效量的红细胞膜融合脂质体用于制造纳米类毒素疫苗的用途，
考察疫苗接种预防毒素侵害的效果。
[0033](8)通过皮下注射纳米类毒素疫苗免疫小鼠，皮下注射耐药细菌，考察疫苗接种预 防耐药细菌感染的效果。
[0034]本专利技术提供了一种高负载成孔毒素的纳米类毒素疫苗及其在预防细菌感染中的用途， 该纳米类毒素疫苗不仅具有较好的安全性，而且具有很高的抗原载量(或表面抗原密 度)，可高效诱导产生免疫反应，可有效预防毒素侵害、细菌感染尤其耐药细菌感染。
[0035]为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本专利技术进行详细描述。需要特别指 出的是，具体实例和附图仅是为了说明，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纳米类毒素疫苗，其特征在于，所述的纳米类毒素疫苗为高负载成孔毒素的红细胞膜融合脂质体；所述的红细胞膜融合脂质体由天然红细胞膜和人工脂质膜构成，其中，天然红细胞膜的膜蛋白与人工脂质膜的质量比为3:80～3:10。2.按权利要求1所述的纳米类毒素疫苗，其特征在于，所述的天然红细胞膜的膜蛋白与人工脂质膜的质量比为3:40～3:20。3.按权利要求1所述的纳米类毒素疫苗，其特征在于，所述的人工脂质膜由磷脂酰胆碱、聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，和/或胆固醇构成。4.按权利要求1或3所述的纳米类毒素疫苗，其特征在于，所述人工脂质膜中，聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺占人工脂质的质量比为5％～15％。5.按权利要求1或3所述的纳米类毒素疫苗，其特征在于，所述人工脂质膜中，聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰乙醇胺占人工脂质的质量比为10％。6.按权利要求3所述的纳米类毒素疫苗，其特征在于，所述人工脂质膜中，所述磷脂和胆固醇的质量和占总脂质的质量比为85％～95％。7.按权利要求或3所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞志清，王建新，何雨薇，陈星，阮双蓉，李海春，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：