分离循环核小体的方法技术

本发明专利技术涉及从生物流体样品中分离包含接头DNA的循环无细胞核小体，特别是疾病来源的核小体的方法。这样的方法允许与疾病来源的核小体相关的遗传学和表观遗传学标记物的改进的分析。的分析。的分析。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】分离循环核小体的方法


[0001]本专利技术涉及富集和分离循环的无细胞核小体，尤其是疾病来源的核小体的方法。这种方法允许与疾病来源的核小体相关的遗传学和表观遗传学标记物的改进的分析。

技术介绍

[0002]细胞DNA以一种叫做染色质的蛋白核酸复合物存在。核小体是染色质结构的基本单位，并由缠绕在蛋白复合物周围的DNA组成。DNA缠绕在连续的核小体周围，其结构常常被说成像“串珠(beads on a string)”，且这形成了开放或常染色质的基本结构。在致密的或异染色质中，该串盘绕和超级盘绕成一个封闭而复杂的结构。
[0003]染色质中的每个核小体由有八个高度保守的核心组蛋白(包括组蛋白H2A、H2B、H3和H4各一对)的蛋白复合物组成。在这个复合物周围包裹着大约145个碱基对(bp)的DNA。另一种组蛋白H1可能位于核心组蛋白之外的核小体上，结合另一个20bp的DNA，产生含有约165bp的DNA的核小体(或染色小体)。组蛋白H1据说充当接头组蛋白，且另外的DNA常常被称为“接头DNA”，即染色体中连接一个核小体和另一个核小体的DNA。在染色体中分离两个核小体的接头DNA有时比20bp长，且长度可能高达80bp。
[0004]成年人类的正常细胞更新涉及每天大量的持续的细胞产生(通过细胞分裂)和细胞死亡。在凋亡过程中，染色质被分解为单核小体和寡核小体，其中一些可能在循环中发现。据报道，在正常情况下，健康受试者中发现的循环核小体水平较低。在患有多种病况(包括许多癌症、自身免疫疾病、炎症、中风和心肌梗死)的受试者中发现升高的水平(Holdenrieder & Stieber, 2009)。死细胞中的核小体也可能流入其他体液，例如尿液、粪便或痰。据报道，循环无细胞核小体主要包含单核小体和相关的DNA，其在细胞死亡时通过消化染色质作为染色质片段产生。
[0005]DNA异常是所有癌症疾病的特征。癌细胞的DNA在许多方面不同于健康细胞的DNA，包括但不限于点突变、易位、基因拷贝数、微卫星异常、DNA链完整性和核苷酸修饰(例如5位处胞嘧啶的甲基化)。为了临床诊断、预后和治疗选择的目的，在活检或手术中去除的癌细胞或组织中，对DNA结构或序列中这些与肿瘤相关的改变进行常规研究。不同肿瘤类型之间以及同一肿瘤疾病的不同患者之间的肿瘤遗传学和表观遗传学特征不同。此外，在同一患者的同一癌症中，随着疾病的进展和在对药物或其他疗法的获得性抗性的发展中，这些特征会随着时间变化。因此，对手术或活检时去除的细胞中的肿瘤DNA的系列研究，可帮助临床医生评估最小残留病、预测患者预后、为患者选择适当的治疗、监测疾病进展，且在早期(可能比放射检测早几个月)检测任何复发或获得性治疗抗性，并允许治疗过程中可能成功的改变。
[0006]然而，组织DNA检验有局限性，因为侵入性活检程序不能对患者重复进行。对于一些患者，可能根本不使用活检。活检操作昂贵，让患者感到不适，造成患者风险，并可能导致手术并发症。此外，患者的肿瘤可能由位于同一肿瘤的不同区域或不同转移灶(转移癌)内的多个肿瘤克隆组成，并非所有克隆都可通过活检取样。因此，在特定时刻在位于肿瘤的不
同区域的不同肿瘤克隆中，组织活检DNA研究在时间和空间上提供肿瘤的快照。
[0007]癌症患者的血液含有循环肿瘤DNA(ctDNA)，这被认为是由于染色质片段或核小体从垂死或死亡的癌细胞释放到循环中而产生的。肿瘤来源的ctDNA以与单核小体预期尺寸一致的小DNA片段的形式循环。对癌症患者相匹配的血液和组织样品的研究表明，患者肿瘤中(但不在他/她的健康细胞中)存在的癌症相关突变也存在于取自相同患者的血液样品的ctDNA中(Newman等人, 2014)。类似地，癌细胞中差异甲基化(通过胞嘧啶残基甲基化的表观遗传学改变)的DNA序列也可以作为循环ctDNA中的甲基化序列检测到。此外，包含ctDNA的无细胞循环DNA(cfDNA)的比例与肿瘤负荷有关，所以可以通过存在的ctDNA比例对疾病进展进行定量监测，也可以通过它的遗传学和/或表观遗传学组分对疾病进展进行定性监测。ctDNA分析可以产生非常有用且临床上精确的数据，所述数据与源自肿瘤内所有或许多不同克隆并在空间上整合了肿瘤克隆的DNA有关。此外，随时间重复采样是一种更实际和更经济的选择。ctDNA分析有可能彻底改变肿瘤的检测和监测，以及在早期检测复发和获得性抗药性，以便通过没有侵入性组织活检程序的肿瘤DNA研究来选择肿瘤治疗方法。这种ctDNA检验可用于研究所有类型的癌症相关DNA异常(例如点突变、核苷酸修饰状态、易位、基因拷贝数、微卫星异常和DNA链完整性)，并适用于常规癌症筛查、定期和更频繁的监测和定期检查最佳治疗方案(Zhou等人, 2012)。
[0008]血液、血浆或血清可用作ctDNA测定的基质，且可采用任何DNA分析方法，包括但不限于遗传DNA测序、表观遗传学DNA测序分析(例如，对于含有5
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甲基胞嘧啶的序列)、PCR、BEAMing、NGS(靶向或全基因组)、数字PCR、等温DNA扩增、冷PCR(较低变性温度下的共扩增
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PCR)、MAP(MIDI激活焦磷酸分解)、PARE(重排末端的个性化分析)和质谱。
[0009]由于DNA异常是所有癌症疾病的特征，并且ctDNA已在其已被研究的所有癌症疾病中观察到，因此ctDNA检验在所有癌症疾病中都具有潜在的适用性。研究的癌症包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、淋巴瘤、口腔癌、白血病、头颈部癌和骨肉瘤(Crowley等人, 2013年；Zhou等人, 2012；Jung等人，2010)。ctDNA检验的性质现在将通过概述一些(非限制性)示例方法来说明。
[0010]第一个实例涉及检测ctDNA中一个与癌症相关的基因序列突变。涉及检测ctDNA中单个基因突变的血液检验通常具有低临床敏感性。这有两个原因。首先，尽管所有癌症都有突变，但特定癌症疾病中任何特定突变的频率通常较低。例如，尽管K
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ras和p53突变被认为是较频繁的癌症突变中的两种，并已在包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌在内的广泛的癌症中进行了研究，但它们分别在23%
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64%和17%
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54%的癌组织样品中被检测到。第二，即使患者的癌组织中确实含有突变，患者血液中存在的突变ctDNA的水平或浓度可能较低而难以检测。例如，在0%
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75%的K
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ras和p53组织阳性患者的ctDNA中可以检测到K
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ras和p53突变。这两种效应的总和意味着，在少于40%的癌症患者血液中检测到K
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ras或p53突变(Jung等人, 2010)。
[0011]第二个实例涉及检测ctDNA中多个与癌症相关的基因序列突变。尽管任何特定基因(例如K
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于从生物流体样品中分离包含接头DNA的循环无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：(i)使所述样品与结合剂接触，所述结合剂结合：(a) 核小体相关接头DNA；(b) 结合接头DNA的染色质结合蛋白；或(c) 与接头DNA相关的核心核小体特征；以及(ii)从所述样品中分离在步骤(i)中结合所述结合剂的核小体。2.一种用于从生物流体样品中分离不包含接头DNA的循环无细胞核小体的方法，其中所述方法包括以下步骤：(i)使所述样品与结合剂接触，所述结合剂结合：(a) 核小体相关接头DNA；(b) 结合接头DNA的染色质结合蛋白；或(c) 与接头DNA相关的核心核小体特征；以及(ii)从所述样品中分离在步骤(i)中不结合所述结合剂的核小体。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中结合核小体相关接头DNA的所述结合剂是选自组蛋白H1、macroH2A或其片段或工程改造的类似物的组蛋白蛋白质。4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中结合核小体相关接头DNA的所述结合剂是染色质结合蛋白或其片段或工程改造的类似物。5.根据权利要求4所述的方法，其中结合接头DNA的所述染色质结合蛋白选自：(a) 克罗莫结构域解螺旋酶DNA结合(CHD)蛋白；(b) DNA(胞嘧啶
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5)
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甲基转移酶(DNMT)蛋白；(c) 高迁移率族盒蛋白(HMGB)蛋白质；(d) 聚[ADP
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核糖]聚合酶(PARP)蛋白；或(e) 甲基
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CpG
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结合结构域(MBD)蛋白，例如MBD1、MBD2、MBD3、MBD4或甲基CpG结合蛋白2 (MECP2)。6.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中与结合接头DNA的染色质结合蛋白结合的所述结合剂选自抗体、affimer或适体。7.根据权利要求6所述的方法，其中结合接头DNA的所述染色质结合蛋白选自：(a) 克罗莫结构域解螺旋酶DNA结合(CHD)蛋白；(b) DNA(胞嘧啶
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5)
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甲基转移酶(DNMT)蛋白；(c) 高迁移率族盒蛋白(HMGB)蛋白质；(d) 聚[ADP
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核糖]聚合酶(PARP)蛋白；或(e) 甲基
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CpG
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结合结构域(MBD)蛋白，例如MBD1、MBD2、MBD3、MBD4或甲基CpG结合蛋白2 (MECP2)。8.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中与接头DNA相关的所述核心核小体特征是组蛋白变体macroH2A。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的方法，所述方法还包括：(iii) 通过免疫测定、质谱和/或DNA分析分析步骤(ii)中分离的无细胞核小体。10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(iii)包括分析所述分离的无细胞核小体的
表观遗传学核小体特征，所述特征选自：组蛋白类型(例如，H2A、H2B、H3、H4组蛋白)、翻译后修饰、组蛋白同种型、特定核苷酸或经修饰的核苷酸(例如甲基化、羟基甲基化或其他核苷酸修饰)、与所述核小体加合的蛋白或其组合。11.根据权利要求9所述的方法，其中所述DNA分析包括DNA测序，包括下一代测序(靶向或全基因组)和甲基化DNA测序分析、BEAMing、PCR，包括数字PCR和冷PCR(较低变性温度下的共扩增
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PCR)、等温扩增、MIDI激活焦磷酸分解(MAP)或重排末端的个性化分析(PARE)。12.根据权利要求1
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11中任一项所述的方法，所述方法还包括将步骤(i)中结合的所述样品与结合核小体或其组分的第二结合剂接触。13.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：比利时意志有限责任公司，
类型：发明
国别省市：