循环转录因子分析制造技术

本发明专利技术涉及通过用于检测循环染色质片段的微创体液测试来检测受试者中的疾病的方法，所述染色质片段包括转录因子和缔合DNA序列作为受试者中疾病存在的指示物，例如癌症。所述方法可以包括对缔合DNA序列测序和/或从体液去除无细胞核小体。去除无细胞核小体。去除无细胞核小体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】循环转录因子分析


[0001]本专利技术涉及通过微创体液测试用于检测受试者中的疾病的方法。本专利技术还涉及包括转录因子作为受试者中疾病存在的指示物的循环染色质片段的测量或检测。

技术介绍

[0002]癌症是具有高死亡率的常见疾病。疾病的生物学理解为涉及从癌前期状态到I、II、III期和最终IV期癌症的进展。对于大多数癌症疾病，死亡率变化很大，这取决于疾病是在早期局部阶段检测(此时可获得有效的治疗选择)还是在晚期检测(此时疾病可能已在受影响的器官内扩散或超过受影响的器官，此时治疗更困难)。晚期癌症症状是不同的，包括大便中可见的血液、尿液中的血液、咳嗽时排出的血液、从阴道排出的血液、无法解释的体重减轻、持续的无法解释的肿块(例如在乳房中)、消化不良、吞咽困难、变为疣或痣以及取决于癌症类型的许多其它可能的症状。然而，大多数由于这样的症状而诊断的癌症已经是晚期并难以治疗。大多数癌症在早期是无症状的，或者存在不帮助诊断的非特异性症状。因此，理想地，应当使用癌症测试早期检测癌症。
[0003]为了解决对简单常规癌症血液测试的需要，已经研究了许多血源性蛋白作为潜在的癌症生物标志物，包括CRC的癌胚抗原(CEA)、肝癌的甲胎蛋白(AFP)、卵巢癌的CA125、胰腺癌的CA19
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9、乳腺癌的CA15
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3和前列腺癌的PSA。然而，它们的临床准确性对于常规诊断用途来说太低，并且它们被认为更好地用于患者监测。
[0004]最近，本领域工作人员研究了循环肿瘤DNA(ctDNA)作为癌症检测的基于血液的生物标志物。无细胞DNA(cfDNA)在血液中作为染色质片段循环，认为染色质片段源自每天大量细胞的细胞死亡(主要通过凋亡)。在凋亡过程期间，染色质片段化成单核小体和寡核小体，其中一些从细胞释放以作为无细胞核小体循环。每个循环无细胞核小体与长度小于200个碱基对(bp)的小DNA片段缔合。类似地，已经从片段组学分析推断出循环中由DNA结合的转录因子或其它非组蛋白染色质蛋白质组成的无细胞染色质片段。在健康受试者中，认为循环染色质片段是造血起源的，并且水平低。在患有多种病况的受试者中发现了升高水平的循环核小体(并因此cfDNA片段)，所述病况包括许多癌症、自身免疫疾病、炎性病况、中风和心肌梗死(Holdenrieder&Stieber，2009)。
[0005]认为癌症患者血液中的至少一些cfDNA源自核小体和其它染色质片段从濒死或死亡的癌细胞释放到循环中(即cfDNA包括一些ctDNA)。对来自癌症患者的匹配的血液和组织样品的研究显示，存在于患者的肿瘤中(但不存在于他/她的健康细胞中)的癌症相关的突变也存在于取自同一患者的血液样品中的cfDNA中(Newman等人，2014)。类似地，在癌细胞中差异甲基化(通过胞嘧啶残基的甲基化表观遗传学改变)的DNA序列也可以作为循环中cfDNA中的甲基化的序列来检测。此外，由ctDNA组成的循环cfDNA的比例与肿瘤负荷有关，因此疾病进展可以通过存在的ctDNA的比例定量监测，也可以通过其遗传和/或表观遗传组成定性监测。ctDNA的分析可以产生高度有用和临床精确的数据，该数据涉及源自肿瘤内所有或许多不同克隆的DNA，并因此其在空间上整合肿瘤克隆。此外，随着时间的推移重复血
液取样是比例如重复组织活检实用且经济得多的选择。ctDNA的分析具有改革肿瘤的检测和监测的潜力，以及在早期检测复发和获得的耐药性，以通过研究肿瘤DNA而不用侵入性组织活检程序来选择肿瘤的治疗。这样的ctDNA测试可以用于研究所有类型的癌症相关的DNA异常(例如点突变、核苷酸修饰状态、易位、基因拷贝数、微卫星异常和DNA链完整性)，并且将适用于常规癌症筛选、常规和更频繁的监测以及最佳治疗方案的常规检查(Zhou等人，2017)。
[0006]血液血浆通常用作ctDNA测定的底物。从血浆中提取cfDNA片段(包括任何ctDNA)(并因此从与核小体、转录因子或其它蛋白质的结合中去除)，并分析核苷酸碱基序列。可以采用任何DNA分析方法，但通常通过使用下一代测序仪仪器的深度测序进行分析。
[0007]由于DNA异常是所有癌症疾病的特征，并且已经观察到ctDNA用于所有已经研究过的癌症疾病，ctDNA测试在所有癌症疾病中都具有适用性。研究的癌症包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、子宫内膜癌、卵巢癌、淋巴瘤、口腔癌、白血病、头颈癌和骨肉瘤(Crowley等人，2013；Zhou等人，2017；Jung等人，2010)。
[0008]cfDNA分析的一个实例方法涉及受试者的cfDNA片段的起源组织或细胞的鉴定。这种方法的基础是，循环中存在的所有cfDNA片段避免了细胞死亡期间或循环中被核酸酶消化，因为它们受到核小体内蛋白质结合的保护而免受核酸酶作用。该方法涉及测定取自受试者的血液样品中cfDNA的核小体片段化模式，并在参考基因组中定位cfDNA片段的基因组位置。片段化的模式对于不同的细胞类型是不同的，并且可以用于鉴定受试者的cfDNA的起源细胞。
[0009]该方法涉及从血浆样品中提取cfDNA(包括任何ctDNA)和对DNA的全基因组测序以检测cfDNA片段所展示的核小体结合的DNA模式。通过计算机分析，使用生物信息学，将cfDNA片段的终点序列定位在一个或多个参考基因组内的基因组位置。参考基因组内cfDNA终点的基因组位置提供了基因组的核小体保护的cfDNA覆盖度的图谱。
[0010]使用生物信息学通过计算机分析，不同细胞类型或组织对受试者中cfDNA的比例贡献也可以通过比较受试者的核小体片段化模式与含有已知相对丰度的来自不同细胞来源的cfDNA的校准样品来确定，如在WO2017012592中所述。
[0011]与含有核小体的染色质片段缔合的cfDNA片段通常长度为120
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200bp。然而，cfDNA的蛋白质结合和保护不限于核小体中cfDNA的组蛋白结合。除了核小体以外或在不存在任何核小体下，其它cfDNA片段(包括活性基因启动子序列)被转录因子、辅因子或其它非组蛋白染色质蛋白质结合。在不存在核小体下，这些蛋白质通常结合并保护在35
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80bp范围的较短的cfDNA片段。然而，如果所用的DNA片段文库制备方法适于分离、扩增和测序长度小于100个碱基对的短DNA片段，则仅在实验上观察到这些较短的cfDNA片段(Snyder等人，2016)。
[0012]活细胞中DNA在基因组中的蛋白质结合的模式随细胞类型而变化，因为不同的DNA序列(包括不同的启动子序列和基因序列)在不同的细胞中有活性。任何细胞类型中DNA的蛋白质结合的模式可以通过核酸酶可接近位点作图来确定，其通过用核酸酶消化从细胞中提取的染色质并对所得蛋白质保护的染色质片段中未消化的DNA测序。因此，如果将血液中的cfDNA片段看作是体内核酸酶消化的产物，则发现的cfDNA序列应对应于从中起源cfDNA
的细胞中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.检测在从人或动物受试者获得的体液样品中包含转录因子和DNA片段的无细胞染色质片段的方法，其包括以下步骤：(i)使所述体液样品与结合所述转录因子的结合剂接触；(ii)检测或测量与所述转录因子缔合的所述DNA片段；和(iii)使用所述DNA片段的存在或量作为所述样品中包含所述转录因子的无细胞染色质片段的量的量度。2.根据权利要求1所述的方法，其包括在步骤(ii)中检测所述缔合DNA片段之前，从所述剩余的体液样品中分离在步骤(i)中结合的所述转录因子。3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中步骤(ii)包括对与所述转录因子缔合的所述DNA片段测序。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其另外包括提取与所述转录因子缔合的所述DNA片段。5.根据权利要求4所述的方法，其另外包括扩增所述提取的DNA片段，例如通过PCR。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中通过实时PCR检测和/或测量与所述转录因子缔合的所述DNA片段。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的方法，其另外包括从所述体液样品中去除无细胞核小体。8.根据权利要求7所述的方法，其包括在步骤(ii)之前，使所述体液样品与结合核小体或其组分的结合剂接触，并去除与所述结合剂结合的所述样品。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的方法，其中所述无细胞染色质片段由所述转录因子和DNA片段组成。10.根据权利要求1
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9中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中检测所述缔合DNA片段之前，用含有至少1％浓度的洗涤剂的缓冲溶液洗涤在步骤(i)中被所述结合剂结合的所述转录因子。11.检测人或动物受试者中的疾病的方法，其包括以下步骤：(i)使从人或动物受试者获得的体液样品与结合转录因子的结合剂接触；(ii)检测或测量与所述转录因子缔合的所述DNA；和(iii)使用DNA的存在或量作为所述受试者中疾病存在的指示物。12.根据权利要求11所述的方法，其包括使用所述转录因子和所述缔合DNA的序列作为指示所述受试者中所述疾病存在的组合生物标志物。13.检测人或动物受试者中受疾病影响的组织的方法，其包括以下步骤：(i)使从人或动物受试者获得的体液样品与结合转录因子的结合剂接触；(ii)对与所述转录因子缔合的所述DNA测序；和(iii)使用所述转录因子的存在和所述缔合DNA的序列作为用于确定所述受试者中受所述疾病影响的所述组织的组合生物标志物。14.根据权利要求13所述的方法，其中受所述疾病影响的所述组织是起源器官。15.根据权利要求11
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14中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症或炎性疾病。16.根据权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：比利时意志有限责任公司，
类型：发明
国别省市：