一种适用于峨眉锥栗基因组DNA的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种适用于峨眉锥栗基因组DNA的提取方法，具体为：用细胞核分离液和DTT处理峨眉锥栗组织粉末样品，收集细胞核；再使用裂解液、有机溶液等试剂提取细胞核DNA从而获得高质量DNA。实验数据表明，通过本发明专利技术提供的细胞核分离液和DTT能够有效消除峨眉锥栗中次级代谢产物的干扰，使所得DNA样本不粘稠，且产量高、成本低，能够满足三代DNA建库测序的要求。求。求。

【技术实现步骤摘要】
10mM DTT混匀以清洗粉末，离心去上清，收集沉淀；
[0016]S22、向沉淀中加入15mL细胞核分离液和15μL 10mM DTT，匀浆后于冰上孵育10
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20min，离心收集细胞核。
[0017]更为优选地，在上述处理过程中，S21所述离心的转速为3000rpm，S22所述离心的条件为7500rpm离心10
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20min。
[0018]在上述提取方法中，裂解液优选为100mM pH 8.0Tris
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HCl、20mM EDTA、1.4M NaCl、2％(w/v)CATB、20％(w/v)PVP、0.4％(v/v)β
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ME(β
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巯基乙醇)。
[0019]在上述提取方法中，优选使用氯仿∶异戊醇＝24:1抽提DNA。
[0020]在上述提取方法中，用异丙醇沉淀DNA的过程具体可以为：加入0.7倍体积的异丙醇，上下混匀后，
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20℃沉淀10min，再13000rpm 4℃离心，收集DNA沉淀。
[0021]在上述提取方法中，S4所述乙醇溶液优选为75％乙醇水溶液，其中75％为体积比。
[0022]在上述提取方法中，含RNase A的缓冲液优选为10mM Tris
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HCl缓冲液。
[0023]本专利技术的有益效果为：
[0024]相对于现有技术，本专利技术在裂解提取DNA之前，使用NIS和DTT预处理组织样本，从而有效去除了细胞内杂质并提取细胞核DNA，进而消除了峨眉锥栗次级代谢产物对最终DNA提取产物的影响，使得提取的DNA不再粘稠，而且实施例数据也表明，通过该方法提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳测试时，条带单一，无明显拖尾。
[0025]本专利技术通过NIS和DTT的配合作用，在促使植物细胞破壁，释放次级代谢产物的同时，有效避免了细胞核DNA的降解，从而使得DNA产量高，避免多次提取，降低了提取成本。
[0026]在本专利技术提供的NIS中，Tris、KCl和NaCl提供盐离子缓冲环境，用于稳定核酸；蔗糖可以维持细胞渗透压，保持细胞形态稳定；Triton X
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100能够增加细胞膜的通透性，亚精胺和精胺能抑制细胞氧化坏死；EDTA和DTT配合，抑制DNase&RNase活性，防止核酸被降解。而且，实验数据表明，峨眉锥栗组织的细胞核提取质量对NIS组分、用量要求较为苛刻，组分含量的改变会导致提取质量严重下降。
[0027]利用本专利技术方法提取的DNA，具有杂质少、产量高、实用性高，成本低的优点，而且DNA质控结果表明，利用本专利技术方法提取的峨眉锥栗基因组DNA满足三代DNA建库测序要求。
附图说明
[0028]图1为实施例1提取的DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
[0029]图2为对比例1提取的DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
[0030]图3为对比例2提取的DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
[0031]图4为对比例3提取的DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果；
[0032]图5为实施例1与对比例1
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3提取的DNA的质量对比结果。
具体实施方式
[0033]为了更好地理解本专利技术，下面结合具体实施例及其附图进一步阐明本专利技术的内容。应当理解的是，此处所描述的具体实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。
[0034]若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议的条件。
所用试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0035]实施例1
[0036]本例通过以下过程提取峨眉锥栗基因组DNA：
[0037]1)取1g峨眉锥栗的叶片放入研钵中，液氮研磨成粉状，将粉末转入50mL离心管中，放置在干冰上。
[0038]2)在冰上用15mL细胞核分离液和15μL 10mM DTT混匀，清洗植物粉末一次，3000rpm离心去上清，收集管底沉淀；其中，细胞核分离液的配方为：将10mM Tris，8mM KCl，140mM NaCl，0.5M蔗糖，2mM亚精胺，2mM精胺，10mM EDTA，0.5％(v/v)Triton X
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100，1％(w/v)PVP，10％(v/v)PEG8000加入500mL ddH2O，并调节pH为8.0，最后补齐定容至1L。
[0039]3)在冰上用15mL细胞核分离液混匀，添加15μL 10mM DTT，并使用组织匀浆器(Giegen)进行植物组织匀浆，冰上孵育15min，然后7500rpm离心20min以收集细胞核。
[0040]4)加入5mL裂解液(具体为：100mM pH 8.0Tris
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HCl、20mM EDTA、1.4M NaCl、2％(w/v)CATB、20％(w/v)PVP、0.4％(v/v)β
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ME以及适量蛋白酶K)，65℃水浴20min。
[0041]5)加入等体积氯仿∶异戊醇(24:1)抽提一次。
[0042]6)离心后，取上清，并加入等体积氯仿抽提一次。
[0043]7)离心后，取上清，并加入0.7倍体积的异丙醇，上下混匀后，
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20℃沉淀10min，于13000rpm 4℃离心，收集DNA沉淀。
[0044]8)用1mL 75％(v/v)乙醇清洗沉淀2次。
[0045]9)加入10mM Tris
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HCl(含RNase A)溶解。
[0046]根据该方法，平行提取制备3个DNA样品，分别记为4
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1、4
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2和4
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3，且本例所得DNA样品澄清透明不粘稠。
[0047]再将提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，具体为：每个DNA样品取100ng与3
×
Loadding Buffer混匀，在100v电压下电泳1h，最后在凝胶成像系统下进行拍照留存。所得电泳检测结果如图1所示：本例提取的DNA条带单一，且没有明显拖尾(图中M1表示全式金的1Kb Ladder，M3表示天根的λHind III)。
[0048]对比例1
[0049]本例采用常规的CTAB法提取峨眉锥栗基因组DNA，过程如下：
[0050]1)取1g峨眉锥栗的叶片放入研钵中，液氮研磨成粉状，将粉末转入15mL离心管中，放置在干冰上。
[0051]2)加入5mL裂解液(同实施例1一致)，65℃水浴20min。
[0052]3)加入等体积氯仿∶异戊醇(24:1)抽提一次。
[0053]4)离心后，取上清，并加入等体积氯仿抽提一次。
[0054]5)离心后，取上清，并加入0.7倍体积的异丙醇，上下混匀后，
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20℃沉淀10min，于13000rpm 4℃离心，收集DNA沉淀。
[0055]6)用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于峨眉锥栗基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、取峨眉锥栗组织样本，并于液氮下研磨成粉末；S2、利用细胞核分离液和DTT处理粉末，收集细胞核；S3、向S2收集的细胞核中加入裂解液反应后，用氯仿和异戊醇的混合液抽提，离心取上清，再加入氯仿抽提，离心取上清，用异丙醇沉淀，离心收集DNA沉淀；S4、用乙醇溶液洗涤DNA沉淀，最后加入含RNase A的缓冲液溶解DNA；所述细胞核分离液的pH＝8.0，且每1L细胞核分离液中含有：10mM Tris，8mM KCl，140mM NaCl，0.5M蔗糖，2mM亚精胺，2mM精胺，10mM EDTA，0.5％v/v Triton X
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100，1％w/v PVP，10％v/v PEG8000。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述峨眉锥栗组织样本为峨眉锥栗的叶片。3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤S2具体为：S21、将0.5
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1g粉末转入容器...

【专利技术属性】
技术研发人员：简文雄，易欣欣，
申请(专利权)人：武汉菲沙基因信息有限公司，
类型：发明
国别省市：