用于富集循环肿瘤DNA的方法技术

本发明专利技术涉及用于富集循环肿瘤DNA的方法。本发明专利技术涉及组蛋白结合剂用于从生物样品中检测、分离和/或纯化肿瘤来源的无细胞核小体或循环肿瘤DNA的用途。本发明专利技术亦涉及使用所述组蛋白结合剂的方法和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
用于富集循环肿瘤DNA的方法本申请为分案申请，原申请的申请日为2015年10月29日，申请号为201580058989.4(PCT/GB2015/053238)，专利技术名称为“用于富集循环肿瘤DNA的方法”。专利
本专利技术涉及一种方法，其用于从血液、血清或血浆中纯化或富集肿瘤来源的循环无细胞核小体及相关的循环肿瘤DNA。专利技术背景细胞DNA以称为染色质的蛋白质-核酸复合物形式存在。核小体为染色质结构的基本单元，且由缠绕在蛋白质复合物周围的双链DNA(dsDNA)而组成。所述DNA以常常称为类似“串珠”的结构缠绕在连续的核小体周围，这形成开放染色质或常染色质的基本结构。在压缩染色质或异染色质中，所述绳串以紧密且复杂的结构为螺旋的和超螺旋的。染色质中的各个核小体由八个高度保守的核心组蛋白(包含各一对组蛋白H2A、H2B、H3和H4)的蛋白质复合物组成。围绕该复合物缠绕着约146个碱基对(bp)的DNA。据报道无细胞核小体包含160-200bpDNA，其可能是因为存在另外的接头DNA。另一种组蛋白H1或H5，充当接头并涉及染色质压缩。成年人中的正常细胞更新包括通过细胞分裂每天产生约1011个细胞并主要通过凋亡使类似数量死亡。在凋亡的过程中，染色质分解成单核小体和寡核小体，其中的某些可存在于循环中。在正常条件下，在健康受试者中发现的循环核小体的水平报道为较低的。在具有多种病况的受试者中发现升高的水平，所述病况包括许多癌症、自身免疫性疾病、炎性病况、中风和心肌梗死(Holdenreider&Stieber，2009)。DNA异常为所有癌症疾病的特征。癌细胞的DNA在许多方面都与健康细胞的DNA不同，包括但不限于点突变、易位、基因拷贝数、微卫星异常、DNA链完整性和核苷酸修饰(例如第5位胞嘧啶的甲基化)。在DNA结构或序列上的这些肿瘤相关的改变，通常在活检或手术时移除的癌细胞或组织中进行研究，以用于临床诊断、预后和治疗目的。肿瘤遗传特征和表观遗传特征，在不同的肿瘤类型之间以及在患有相同肿瘤疾病的不同患者之间均不同。此外，随着所述疾病进展以及在形成对药物或其他疗法的获得性耐药期间，在相同患者的相同癌症中，这些特征亦随时间改变。因此，对手术或活检时移除的细胞中的肿瘤DNA的连续研究，可帮助临床医师监测疾病进展并在早期(可能比放射学检测早许多个月)检出任何复发或获得性治疗耐药性，并允许疗程中有可能的成功的变化。然而，组织DNA检测具有局限性，因为不能对患者反复进行侵入性活检程序来用于监测目的。对于一些患者而言，根本不能使用活检。进行活检很昂贵，对患者而言为不适的，造成患者风险，且可能导致手术并发症。此外，患者中的肿瘤可由位于相同肿瘤的不同区域内或不同转移内(在转移癌中)的多个肿瘤样克隆组成，其并非全部都可在活检上取样。因此，在处于时间上的特定时刻的位于肿瘤的不同区域内的不同肿瘤克隆之中，组织活检DNA研究同时在时间上和空间上提供肿瘤的快照(snap-shot)。癌症患者的血液含有循环肿瘤DNA(ctDNA)，认为其来源于从濒死或死亡的癌细胞释放到循环中核小体或染色质片段。来自癌症患者的匹配血液和组织样品的研究显示，存在于患者肿瘤中(但不存在于他/她的健康细胞中)的癌症相关的突变，亦存在于获自相同患者的血样的ctDNA中(Newman等，2014)。类似地，在癌细胞中差异甲基化(通过胞嘧啶残基的甲基化在表观遗传上改变)的DNA序列，在循环的ctDNA中亦可检测为甲基化的序列。此外，由ctDNA组成的无细胞循环DNA(cfDNA)的比例与肿瘤负荷相关，因此可通过ctDNA存在的比例定量监测同时通过其遗传和/或表观遗传组成定性监测疾病进展。ctDNA的分析可产生关于起源于肿瘤内的所有或许多不同克隆的DNA的非常有用且临床上精确的数据，并其因此在空间上整合所述肿瘤克隆。此外，随时间的重复取样为远更实际且经济的选项。(ctDNA)的分析具有变革肿瘤的检测和监测的潜力，以及在早期检出复发和获得性耐药，用以通过不使用侵入性组织活检程序的肿瘤DNA研究来选择用于肿瘤的治疗。所述ctDNA检验可用于研究所有类型的癌症相关的DNA异常(例如点突变、核苷酸修饰情况、易位、基因拷贝数、微卫星异常和DNA链完整性)，且对于常规癌症筛查、定期和更频繁的监测以及定期检查最佳治疗方法而言应具有适用性(Zhou等，2012)。血液、血浆或血清可用作ctDNA测定的基质，且可使用任何DNA分析法，包括但不限于DNA测序、表观遗传DNA测序分析(例如对于含5-甲基胞嘧啶的序列)、PCR、BEAMing、NGS(靶定基因组或全基因组)、数字PCR、冷PCR(较低变性温度下的共扩增-PCR)、MAP(MIDI-激活的焦磷酸解)、PARE(重排末端的个性化分析)和质谱法。因为DNA异常为所有癌症疾病的特征，且对于其中已进行研究的所有癌症疾病中均观察到ctDNA，所以ctDNA检验在所有癌症疾病中均具有适用性。研究的癌症包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、淋巴瘤、口腔癌、白血病、头颈癌和骨肉瘤(Crowley等，2013；Zhou等，2012；Jung等，2010)。现在将通过概述三个(非限制性的)示例方法来阐述ctDNA检验的特性。第一个实例包括检测ctDNA中的一种癌症相关的基因序列突变。包括检测ctDNA中的单基因突变的血液检验，一般具有低临床灵敏性。对此有两个原因。首先，尽管所有癌症均具有突变，但特定癌症疾病中任何特定突变的频率通常很低。例如，尽管K-ras和p53突变被认为是更高频癌症突变中的两个，且已在包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌在内的大范围的癌症中进行研究，但其分别在23%-64%和17%-54%的癌组织样品中检出。其次，即便患者的癌组织确实含有所述突变，但存在于所述患者血液中的突变ctDNA的水平或浓度可能很低且难以检出。例如，K-ras和p53突变可在0%-75%的K-ras和p53组织阳性患者的ctDNA中检出。这两个结果的总和，意味着K-ras或p53突变在小于40%的癌症患者的血液中检出(Jung等，2010)。第二个实例包括检测ctDNA中的多个癌症相关的基因序列突变。尽管诸如K-ras或p53等任何特定基因的突变可能仅存在于少数癌症中，但所有癌症均含有突变，所以研究足够大量的突变在原则上应利于检出大多数或甚至所有肿瘤。因此，增加所述检验的临床灵敏性的一个方式为检测许多基因中的大范围的突变。Newman等采用该方法用于非小细胞肺癌(NSCLC)并研究了来自139个周期性发生的突变基因的521个外显子和13个内含子序列。研究的突变包括多个种类的癌症相关的遗传改变，包括单核苷酸变异(SNV)和融合基因。以此方式，作者报道检出大于95%的II-IV期肿瘤和大于50%的I期肿瘤，在ctDNA血液检验中以96%特异性(Newman等，2014)。第三个实例包括检测对于ctDNA中的特定基因序列的癌症相关的表观遗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于在生物样品中检测肿瘤来源的循环核小体的表观遗传表位的免疫测定法，其中所述方法包括步骤：/n(i)使所述样品与组蛋白H3.1和/或H3.2和/或H3t结合剂接触；/n(ii)使所述核小体或样品与第二结合剂接触，所述第二结合剂与所述表位结合；/n(iii)检测和/或定量所述第二结合剂与所述表位的结合；和/n(iv)使用所述结合的存在或程度作为所述样品中的肿瘤来源核小体的特定表位的存在的测量结果。/n

【技术特征摘要】
20141029 GB 1419225.6;20141030 GB 1419299.11.一种用于在生物样品中检测肿瘤来源的循环核小体的表观遗传表位的免疫测定法，其中所述方法包括步骤：
(i)使所述样品与组蛋白H3.1和/或H3.2和/或H3t结合剂接触；
(ii)使所述核小体或样品与第二结合剂接触，所述第二结合剂与所述表位结合；
(iii)检测和/或定量所述第二结合剂与所述表位的结合；和
(iv)使用所述结合的存在或程度作为所述样品中的肿瘤来源核小体的特定表位的存在的测量结果。


2.一种用于在生物样品中检测肿瘤来源的循环核小体的表观遗传表位的免疫测定法，其中所述方法包括步骤：
(i)使所述样品与第一结合剂接触，所述第一结合剂与所述表位结合；
(ii)使所述核小体或样品与组蛋白H3.1和/或H3.2和/或H3t结合剂接触；
(iii)检测和/或定...

【专利技术属性】
技术研发人员：JV米卡莱夫，M赫佐格，ME埃克莱斯顿，
申请(专利权)人：比利时意志有限责任公司，
类型：发明
国别省市：比利时;BE