NDM-1耐药蛋白双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术提供一种用于检测细菌中NDM‑1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及其检测方法，包括包被有单克隆抗体3H5的酶标板、检测抗体4G1‑HRP、NDM‑1蛋白。本发明专利技术选用3H5作为捕获抗体，4G1‑HRP作为检测抗体研制了NDM‑1双抗夹心ELISA检测试剂盒，并对其进行了方法学系统评估，结果显示试剂盒特异性好，灵敏度高，为NDM‑1阳性耐药菌的快速检测提供了一种技术手段。

【技术实现步骤摘要】
NDM-1耐药蛋白双抗夹心ELISA检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及一种用于检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒及其检测方法，属于免疫学分析

技术介绍
随着微生物与人类的不断斗争，在抗菌药物的使用过程中无可避免的会有“超级细菌”的出现。所谓的“超级细菌”并不仅仅单指一种细菌的名称，而是一类几乎对所有抗生素都有强劲耐药性的细菌统称。新德里金属β-内酰胺酶(NewDelhimetallo-beta-lactamase,NDM)是一种新型的碳青霉烯酶，于2009年首次从印度新德里一名患者体内的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中分离得到。由于该类细菌对包括碳青霉烯类药物在内的所有β-内酰胺类抗菌药物均耐药，且携带耐氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素基因，导致其感染治疗十分困难。因此也被称为“超级细菌”，也以其发现地新德里命名。2012年中国农业大学研究人员对北京周边养殖场和屠宰场样品携带blaNDM-1基因的细菌进行检测，检测到一株产NDM-1的鲁氏不动杆菌。这也是中国首次在动物养殖场中发现，由此表明NDM-1基因在动物中传播具有潜在危险，动物性食品安全向人们敲响警钟。目前现有检测NDM-1的方法主要有纸片扩散法、Etest检测法、微量稀释法、PCR等。其中，纸片扩散法缺乏特异性，仅适合初筛试验，Etest检测法、微量稀释法灵敏度低，而PCR可通过特异性引物对NDM-1阳性细菌进行确证，但对仪器设备的要求较高，且操作复杂，不易在临床应用，而ELISA作为常用的检测微生物的方法，具有快速、灵敏、高通量、特异性好等特点，因此建立一种用于检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA试剂盒及方法具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种灵敏度高、特异性强、操作简便、检测快速的检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗夹心酶联免疫试剂盒及检测方法。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种用于检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：包被有单克隆抗体3H5的酶标板、检测抗体4G1-HRP、NDM-1蛋白。在一个实施方案中，所述检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：1）重组NDM-1(29-270)蛋白为通过截断NDM-1序列，N端添加GST标签，克隆至表达载体pGS-21a，并转化入大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌株中，经IPTG诱导表达，使用Ni-NTA镍柱纯化得到的；上述重组NDM-1（29-270）蛋白氨基酸序列为序列1。在一个实施方案中，所述NDM-1单克隆抗体3H5，4G1为采用重组NDM-1（29-270）蛋白免疫小鼠，经融合、克隆、筛选，得到的；所述单克隆抗体3H5的重链可变区的氨基酸序列为序列2；所述单克隆抗体3H5的轻链可变区的氨基酸序列为序列3；所述单克隆抗体4G1的重链可变区的氨基酸序列为序列4；所述单克隆抗体4G1的轻链可变区的氨基酸序列为序列5。在一个实施方案中，所述检测抗体4G1-HRP的制备方法包括如下步骤：（1）称取5mgHRP溶于1mL三蒸水中，逐滴缓慢加入0.20mL新配的0.1MNaIO4溶液，4℃避光搅拌25min，活化HRP，颜色由棕色变为绿色；上述溶液装入透析袋中，用1M，pH4.4的醋酸钠缓冲液中4℃过夜透析，然后10000r/min，4℃，离心10min，去除沉淀，得到透析后的HRP；（2）将单克隆抗体4G1用0.2M，pH为9.5的碳酸缓冲液4℃透析过夜，得到透析后的抗体；（3）将透析后的HRP加入0.16M乙二醇（每mg酶加0.1mL），4℃避光搅拌1h，然后加入透析后的抗体；两者混匀后用0.05M，pH为9.5的碳酸缓冲液4℃透析过夜，得到HRP-抗体混合液；（4）对0.15MpH7.4PBS透析过夜；搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸氨，4℃避光搅拌3h；4℃，10000rpm离心15min，弃上清；PBS溶解沉淀，得到经辣根过氧化物酶标记的检测抗体HRP-4G1。在一个实施方案中，所述检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，还包括如下步骤：1）包被有单克隆抗体3H5的酶标板的制备：将单克隆抗体3H5用0.05M碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释成浓度为5μg/mL，每孔100μL，4℃包被过夜后洗板；然后每孔加入100μL2%BSA（含0.3%NaN3），37℃，湿度30-40%封闭2h，然后37℃，湿度30-40%恒温干燥2h；2）检测抗体稀释液：0.01MpH7.4的PBST溶液；3）检测抗体工作液的制备：检测抗体4G1-HRP按照1:30000比例稀释后备用；4）样品稀释液的制备：0.01MpH7.4的PBS溶液；5）底物A液的制备：含0.08%过氧化脲、0.025%PEG-2000、3.58%十二水合磷酸氢二钠、0.96%一水合柠檬酸钠水溶液，调pH值至7.4；6）底物B液的制备：含1.03%一水合柠檬酸钠、0.04%TMB、0.0008%硫代硫酸钠、0.1%光稳定剂292、3%DMF水溶液，调pH值至5.0。本专利技术的第二个目的在于提供一种NDM-1蛋白双抗夹心ELISA检测方法，该方法操作简便，检测快速，特异性强，灵敏度高。具体的说，一种细菌中NDM-1蛋白双抗夹心ELISA检测法，采用以下步骤：（1）以pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲溶液包被捕获抗体3H5(5μg/mL)，酶标板中每孔加入100μL，4℃过夜，使其与酶标板紧密结合；（2）次日，弃去孔内溶液，用洗涤液(PBST)洗板3次，每次3min；每孔加入100μL2%BSA（含0.3%NaN3）进行封闭，37℃温育2h；封闭结束后向酶标板孔内加入细菌裂解液，并同时设置阴性对照孔（0.01MPB，pH7.4）和阳性对照孔（NDM-1蛋白，2ng/mL），100μL/孔，37℃孵育1h；（3）弃去孔内溶液，洗板3次后，加入检测抗体4G1-HRP，100μL/孔，37℃孵育1h；（4）弃去孔内溶液，洗板3次，最后加入的显色剂TMB溶液（现用现配），每孔100μL，37℃孵育10min。在HRP作用下，显色剂发生颜色变化，加入终止液（2MH2SO4）50μL/孔；（5）测定：用酶标仪检测OD450nm。在一个实施方案中，所述试剂盒中还包括终止液、封闭液和洗涤液；具体的所述终止液为2mol/L硫酸；所述封闭液为2%BSA（含0.3%NaN3）；所述洗涤液为含0.1%Tween-20的0.01MpH7.4PBST溶液。所述NDM-1蛋白阳性对照为NDM-1（29-270），浓度为2ng/mL。本专利技术的有益效果是：本专利技术制备了NDM-1单克隆抗体，并建立了细菌中NDM-1蛋白的双抗夹心ELISA方法，该方法检测NDM-1（29-270）蛋白LOD为0.5ng/mL，与大肠杆菌、不动杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：包被有单克隆抗体3H5的酶标板、检测抗体4G1-HRP、NDM-1蛋白标准品。/n

【技术特征摘要】
20200316 CN 20201018038641.一种用于检测细菌中NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，包括：包被有单克隆抗体3H5的酶标板、检测抗体4G1-HRP、NDM-1蛋白标准品。


2.根据权利要求1所述的检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：
所述捕获抗体3H5和检测抗体4G1为采用NDM-1重组蛋白免疫小鼠，经融合、克隆、筛选，得到的。


3.根据权利要求1或2所述的检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：
所述单克隆抗体3H5的重链可变区的氨基酸序列为序列2；
所述单克隆抗体3H5的轻链可变区的氨基酸序列为序列3；
所述单克隆抗体4G1的重链可变区的氨基酸序列为序列4；
所述单克隆抗体4G1的轻链可变区的氨基酸序列为序列5。


4.根据权利要求2所述的检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：
重组NDM-1(29-270)蛋白为通过截断NDM-1序列，N端添加GST标签，克隆至表达载体pGS-21a，并转化入大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌株中，经IPTG诱导表达，使用Ni-NTA镍柱纯化得到的。


5.根据权利要求4所述的检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，重组NDM-1(29-270)蛋白氨基酸序列为序列1。


6.根据权利要求1所述的检测NDM-1耐药蛋白的双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测抗体4G1-HRP的制备方法步骤包括：
（1）称取5mgHRP溶于1mL三蒸水中，逐滴缓慢加入0.2mL新配的0.1MNaIO4溶液，4℃避光搅拌25min，活化HRP，颜色由棕色变为绿色；上述溶液装入透析袋中，于1MpH4.4的醋酸钠缓冲液中4℃过夜透析，然后10000r/min，4℃，离心10min，去除沉淀；得到透析后的HRP；
（2）将单克隆抗体4G1置于0.2MpH9.5的碳酸缓冲液4℃透析过夜，得到透析后的抗体；
（3）将透析后的HRP加入0.16M乙二醇（每mg酶加0.1mL），4℃避光搅拌1h，然后加入透析后的抗体；两者混匀后用0.05M，pH为9.5的碳酸缓冲液4℃透析过夜，得到HRP-抗体混合液；
（4）再于0.15MpH7.4PBS透析过夜；搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸氨，4℃避光搅拌3h；4℃，10000rpm离心15m...

【专利技术属性】
技术研发人员：马立才，刘河冰，崔乃元，
申请(专利权)人：北京维德维康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11