一种ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术属于体外诊断试剂技术领域，提供了一种ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒。所述的ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，包括包被有抗H‑FABP单克隆抗体的酶标板、HRP标记的检测用抗H‑FABP多克隆抗体、标准品、标准品稀释液、样本稀释液、浓缩洗涤液、显色液A、显色液B、终止液、检测抗体稀释液。本发明专利技术的检测试剂盒灵敏度较高，试剂盒的最低检测限低至1pg/mL；本发明专利技术试剂盒均一性良好，稳定性高，批内变异系数小于10％，批间变异系数都小于5％。该试剂盒与血清中易干扰测试的血清总胆红素TBIL和甘油三酯TG的交叉反应很低，不会对H‑FABP的测量造成干扰。

【技术实现步骤摘要】
一种ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒
本专利技术属于体外诊断试剂
，尤其涉及一种ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒。
技术介绍
急性心肌梗死(AMI)是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌缺血坏死疾病，临床上多表现为剧烈而持久的胸骨后疼痛，严重时可并发心律失常、休克或心力衰竭，其病死率高、危害性大。AMI通常发病突然且发展迅速，早发现、早治疗对缩小梗死面积，保护心脏功能有重大意义，可以说是挽救患者生命、提高患者预后的关键所在。心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)为一种小分子蛋白质(15.0KD)是心肌细胞内的脂肪酸载体，是目前心肌早期缺血损伤性的敏感标志物之一。在心肌中的水平比骨骼肌高10倍。肾脏、肝脏和小肠中的水平很低。具有较好的心肌特异性。心肌损伤后心肌细胞对缺血、缺氧的敏感性增加。需动员脂肪酸供能，致使心肌细胞内心型脂肪酸结合蛋白水平增加，最终导致在血液中的水平升高。AMI发生时，H-FABP在心肌缺血缺氧而尚未坏死时即可检测到，心肌受损后2h迅速升高，并于6h达到峰值，而在12～24h内恢复正常，相比较cTnI、CK-MB等其他心肌坏死血清生化标志物具有更高的时效性。H-FABP是一种无酶活性的蛋白质，其定性检测与定量检测都需要借助免疫学方法。从最早的放射免疫法到最近的乳胶微粒增强免疫比浊法以及胶体金免疫技术在H-FABP测定中的应用，H-FABP的临床检测经历了一个检测速度越来越快。1.放射免疫法放射免疫法是最早被报道用于FABP定量检测的方法，Ockner等于1974年在研究IFABP时采用了放射免疫法，他们用14C标记抗血清与待测标本反应，通过测定免疫沉淀中放射性比活度来检测相应的I-FABP浓度。随后，Ockner等于1982年又利用相同的方法完成了L-FABP的定量检测。鉴于H-FABP与I-FABP和L-FABP相似的分子大小以及不同的抗原决定簇，此法应同样适用于H-FABP的定量检测。然而，放射免疫法准备及测定过程都较为繁琐，所需的放射性同位素价格昂贵且存在放射性污染，在临床检测中缺乏实用价值。2.酶免疫法(1)竞争性酶联免疫吸附试验(ELISA)：随着H-FABP单克隆抗体的制备成功，ELISA逐渐成为检测H-FABP的主流方法，由于H-FABP相对分子质量较小，竞争性ELISA最先进入人们的考虑范围并于1989年被Knowlton等研制成功，实验采取鼠抗兔H-FABP单克隆抗体作为捕获抗体，用定量的过氧化物酶(HRP)标记的标准抗原与标本中的抗原竞争性结合捕获抗体，最后通过底物显色反应达到标本中抗原定量的目的，此方法检测时间长达16h，不能满足临床检测的需求，但是竞争性ELISA定量H-FABP血浆浓度的成功证明了基于单克隆抗体的ELISA用于H-FABP定量的可行性，为以后ELISA的改进积累了经验；(2)双抗体夹心：ELISA:Ohkaru等于1995年报道了他们研制成功的双抗体夹心ELISA定量检测H-FABP浓度的试剂盒，他们采用8E3抗人H-FABP抗体作为捕获抗体，HRP标记的8B9抗人H-FABP抗体作为标记抗体，试验通过标本抗原与捕获抗体结合、抗原-捕获抗体复合物与标记抗体结合、底物的加入与显色以及测量620nm波长的吸光度4个步骤完成，检测时间缩短至75min，最低检测浓度为1.25μg/L，血浆标本的检测线性范围达到220μg/L，组内与组间不精密度分别低于7.9％和7.0％，上述技术参数显示该试剂盒表现比较令人满意，随后Wodzing等于1997年研制成功了一种一步法双抗体夹心ELISA用于血浆H-FABP浓度的定量，这种技术基于一种高亲和力单克隆抗体的构建成功，它与上述两步法的不同之处在于：将待测抗原与酶标抗体一次性加入捕获抗体包被的固相载体表面，一步法双抗体夹心ELISA使得血浆H-FABP定量的检测时间缩短到45min，最低检测浓度可达到0.20μg/L，组内与组间不精密度分别低于6.0％和11.0％，但是此方法检测的线性范围很窄，只到6μg/L。2000年有学者等介绍了一种全自动的双抗体夹心ELISA，该技术利用全自动酶标仪以及微量进样系统使得ELISA的操作得以自动化，非常适合临床大批量标本的检测，该检测方法组间不精密度为2.3％-7.0％，相比手工法有了进一步的改进，总之，双抗体夹心ELISA试剂盒的研制成功标志着实验室定量检测H-FABP技术的成熟，该方法的线性范围、不精密度等指标均比较理想，但是已经报道的ELISA检测时间最快也需要45min，对于出现于AMI早期的心肌标志物来讲，这无疑限制了这种检测方法的应用；(3)基于原位沉淀加强椭圆滤计比浊的ELISA：Robers等于1999年介绍了一种可用于H-FABP定量的基于原位沉淀加强椭圆滤计比浊的ELISA，该ELISA与上述标准ELISA不同之处在于使用了致沉淀底物二氨基联苯氨(DAB)而非经典使用的显色底物四甲基联苯氨(TMB)作为HRP的底物，最后通过椭圆滤计比浊法测定固相载体表面的浊度增加情况，并据此计算出标本中H-FABP的浓度，由于DAB经HRP作用后的沉淀产物多集中在抗原抗体结合物原位的固相载体表面，所以浊度的增加主要体现在固相载体表面这一二维的结构中，而经典的TMB底物产生的颜色变化则分布在反应孔这个三维的结构中，相比之下浊度的增加更为敏感，所以依据这个原理建立的ELISA有着比以往ELISA更高的灵敏度与更快的反应时间，H-FABP的检测最低浓度可达到100fmol/L，相当于1.25×10-4μg/L，而检测时间也相应缩短至10～20min，但是其检测浓度的线性范围相对较窄，只有10μg/L，对于浓度较高的AMI患者标本，只能通过稀释进入检测的线性范围。3.免疫传感器技术的应用免疫传感器技术将免疫学方法的特异性与传感器方法的敏感性结合在一起，可用于非酶类蛋白质的检测。1996年，Siegmann-Thoss等成功设计出了第1种利用免疫传感器检测H-FABP浓度的方法。该免疫传感器采用Clark型氧电极，用固定于硝酸纤维素膜上抗H-FABP抗体为捕获抗体，葡萄糖氧化酶(GOD)标记的另一抗H-FABP抗体为标记抗体，标记好抗体的免疫膜被包被于氧电极上，加入待测抗原和底物葡萄糖后通过氧电极检测出的GOD含量换算出待测抗原的浓度。基于这种免疫传感器的检测方法检测时间需要30min，检测下限为5μg/L，线性范围可达50μg/L。但是，固定了捕获抗体的免疫膜用10次就需要更换新的，并重新包被于电极表面，这需要耗费大量的人力物力，不适用于临床标本的检测。Schreiber等于1997年研制成功一种基于可抛弃电极的免疫传感器系统用于血浆H-FABP浓度的定量。这种传感器系统采用Ag/AgCl参比电极，捕获抗体被事先通过吸附作用固定在电极表面，用双抗体夹心模式捕获待测抗原并通过碱性磷酸酶标记的第二抗体完成免疫反应。加入含有氨苯基磷酸的底物液后，碱性磷酸酶可以催化氨苯基磷酸生成氨基苯酚，后者在电本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，包括包被有抗H-FABP单克隆抗体的酶标板、HRP标记的检测用抗H-FABP多克隆抗体、标准品、标准品稀释液、样本稀释液、浓缩洗涤液、显色液A、显色液B、终止液、检测抗体稀释液。/n

【技术特征摘要】
1.一种ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，包括包被有抗H-FABP单克隆抗体的酶标板、HRP标记的检测用抗H-FABP多克隆抗体、标准品、标准品稀释液、样本稀释液、浓缩洗涤液、显色液A、显色液B、终止液、检测抗体稀释液。


2.如权利要求1所述的ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述包被有抗H-FABP单克隆抗体的酶标板的制备方法，包括以下步骤：
1)将包被抗H-FABP单克隆抗体溶于包被缓冲液中至包被抗体浓度为2ug/mL，得到混合液；
2)将步骤1)获得的混合液加入微孔板的孔中，每孔0.1mL，加盖板膜，2-8℃放置18-24小时；用0.5％Tween20-PBS洗涤5次；再向每孔中加入封闭液，每孔0.12mL，在2-8℃放置18-24小时；用0.5％Tween20-PBS洗涤5次；置25-35℃干燥间内，湿度<40％，干燥时间20-24小时，铝箔袋封装板子，2～8℃保存，得到酶标板。


3.如权利要求2所述的ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液的组成：无水碳酸钠1.59g；NaHCO32.98g；苋菜红0.01g；纯化水定容至1000mL；
所述封闭液的配方：Na2HPO4·12H2O5.20g；NaH2PO4·2H2O0.87g；蔗糖20.00g；干酪素10.00g；BSA10.00g；纯化水定容至1000mL。


4.如权利要求1所述的ELISA法定量检测心型脂肪酸结合蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述HRP标记的检测用抗H-FABP多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
(1)抗H-FABP多克隆抗体在0.01MpH9.0-9.5的碳酸盐缓冲溶液中透析，终浓度为5mg/mL；
(2)取10mgHRP溶解于2mLH2O，终浓度为5mg/mL，获得HRP溶液；
(3)向步骤(2)获得的HRP溶液中加入0.4mL浓度为37.5mg/mL的NaIO4溶液，室温避光搅拌氧化20min；
(4)氧化后的酶液在1mMpH4.4的醋酸盐缓冲液4℃透析过夜，透析截留分子量12000-14000，换液3次；
(5)取出透析袋中溶液，加入0.2MNa2CO3缓冲溶液，调至pH为9.0-9.5，并迅速与步骤(1)获得的pH9.0的抗体1:1混合，室温避光轻微搅拌2h；
(6)加入新配的6mg/mLNaBH4溶液100ul，混匀，4℃反应还原2h；
(7)还原后的反应体系，于0.15MpH7.4PBS中4℃透析过夜，换液3次；
(8)加入BSA使终浓度为2-3mg/mL，混匀，10000rpm×3min，收...

【专利技术属性】
技术研发人员：王立杰，艾冰花，赵京超，常青侠，陈蒙蒙，武祥伟，
申请(专利权)人：艾维可生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37