一种S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术适用于生物技术领域，具体涉及一种S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒及其使用方法，所述S100B蛋白的检测试剂盒包括包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液、标准品、标准品稀释液、样本稀释液、浓缩洗涤液、发光液A和发光液B、检测抗体稀释液。本发明专利技术实施例提供的试剂盒待测品(标准品或血清样本)与辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液的反应时间为2小时；临床常见的病理性黄疸和脂血症标本对血清S100B蛋白测定未见明显干扰；批内及批间平均变异均小于5.0％，具有简便、快速、特异、敏感，适于临床常规应用的技术效果。

【技术实现步骤摘要】
一种S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒及其使用方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒及其使用方法。
技术介绍
S100B蛋白是一个分子量为21KD的酸性钙结合蛋白。由于其分子量较小，并大量存在中枢神经系统中，在体内发挥着多种生物学功能，因此，它与血脑屏障和脑损伤有着密切的关系。目前，国内外已对S100B蛋白，特别是对其在血清中的动态变化水平在疾病的诊断、预后方面的临床意义方面进行了大量研究。S100B的检测实际是对S100B亚单位的检测，S100B蛋白检测主要采用免疫学方法，目前主要有放免分析法(RIA)或免疫放射测定法(IRMA)、荧光免疫测定法(FIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)和电化学发光法(ECLIA)，用于检测脑脊液、血液、尿、羊水等中S100B蛋白的含量，从而进行进一步的临床诊断。放射免疫(RIA)或免疫放射测定法(IRMA)测定的基本原理是标记抗原与未标记待测抗原竞争反应系统中有限抗体上的特异结合位点，其灵敏度为0.2μg/L。但因存在放射污染和危害，核素半衰期短，试剂盒稳定期短，操作繁琐等不足而应用受限。荧光免疫法(FIA)的基本原理是以荧光色素标记的特异性抗体，与待测抗原结合，测定荧光的强度以计算出标本中抗原的含量。Wiesmann等采用FIA方法，用抗S100B蛋白单抗包被微孔板.与待测抗原及生物素标记兔抗S100B抗体结合.形成双抗体夹心复合物。此法灵敏度较IRMA显著提高，达到0.015μg/L，重复性好，可自动化。但须专门的荧光设备，因此在临床上不易普及。酶联免疫吸附试验(ELISA)采用原核系统表达的S100B作为标准品并制备抗S100B单克隆抗体，建立的双抗体夹心法，其灵敏度高达0.0125μg/L，线性范围0-3.2μg/L，CV<6.9％。ELISA法较RIA、FIA具有灵敏度高、无污染、操作简便、报告结果快速等诸多优点，在临床上具有极大的应用价值。我国已有国产化ELISA试剂，有较好的稳定性和灵敏度。电化学发光法(ECLIA)是利用链霉亲和素包被的磁珠和生物素化的抗体与S100B抗体连接为一体，形成双抗体夹心，最后通过与抗体偶联的发光剂和电子供体TPA通过氧化还原反应在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与发光剂的浓度呈线性关系，故可测出待测抗原的含量。电化学发光法的优点：⑴标记物的再循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定；⑵敏感度高，可达pg/mL水平；⑶线性范围宽；⑷反应时间短，20min以内可完成测定；⑸试剂稳定性好，2～5℃可保持一年以上，是目前较为常用的检测方法。与ELISA法相比其主要优势为其反应动力学较ELISA方法更快，并且具有更大的固相结合表面。分析方法的设计与ELISA方法有很多相似处，但在实验设计上却拥有更多的灵活性。因此，为了满足临床检测需求，更快、更准确的实现对血清中S100B蛋白的定量检测，亟需一种定量测定血清中S100B浓度水平的体外诊断试剂盒，为颅脑损伤和脑血管疾病诊断及预后判断提供帮助。
技术实现思路
本专利技术实施例提供一种S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒，以满足临床检测需求，更快、更准确的实现对血清中S100B蛋白的定量检测。本专利技术实施例提供的S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒，包括：包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液、标准品、标准品稀释液、样本稀释液、浓缩洗涤液、发光液A和发光液B、检测抗体稀释液。本专利技术实施例还提供一种S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：(1)配制如下溶液：用检测抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液，使辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液与检测抗体稀释液的比例为1:10000；用检测抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液，使辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体与检测抗体稀释液的体积比为1:5000，得到酶结合物；用标准品稀释液溶解标准品，得到多个浓度梯度变化的标准品溶液；将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水按照1:20的体积比稀释得到洗涤液。(2)绘制标准曲线：在包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板的相应孔中分别加入校准品溶液50μL，然后每孔分别加入辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液100μL，轻轻振荡混匀；用封板膜封板后置37℃温育2小时后，用所述洗涤液充分洗涤5遍，扣干；每孔加入发光液A、B液各25μL，轻轻振荡混匀；用空白孔调零点后，使用发光仪测定各孔光密度值；使用双对数log-log线性拟和方式进行数据处理，以各校准品的光密度值的对数为纵坐标，各校准品的浓度的对数为横坐标作图，得到标准曲线；(3)待测样品检测在包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板的相应孔中分别加入待测样品50μL，然后加入辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液100μL，轻轻振荡混匀；用封板膜封板后置37℃温育2小时后，用所述洗涤液充分洗涤5遍，扣干；加入发光液A、B液各25μL，轻轻振荡混匀；用空白孔调零点后，使用发光仪测定光密度值；将待测样本溶液的光密度值代入标准曲线，得到待测样本溶液中S100B的含量。本专利技术实施例提供的试剂盒，待测品(标准品或血清样本)辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液的反应时间为2小时；临床常见的病理性黄疸和脂血症标本对血清S100B蛋白测定未见明显干扰；批内及批间平均变异均小于5.0％，具有简便、快速、特异、敏感，适于临床常规应用的技术效果。附图说明图1是本专利技术实施例提供标准曲线示意图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例提供的一种S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒，包括：包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液、标准品、标准品稀释液、样本稀释液、浓缩洗涤液、发光液A和发光液B、检测抗体稀释液。在本专利技术实施例中，所述辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液通过如下方法制得：抗体纯化、定量后，在0.01mol/L、pH＝9.0～9.5的碳酸盐缓冲溶液中透析，至浓度为5mg/mL；配置5mg/mL的辣根过氧化物酶水溶液；向所述辣根过氧化物酶水溶液中加入0.4mL浓度为37.5mg/mL的NaIO4，室温避光搅拌20min，得到氧化后的酶液；将所述氧化后的酶液在1mmol/L、pH＝4.4、4℃的醋酸盐缓冲液透析过夜，换液3次；取出透析袋中的溶液，加入0.2mol/LNa2CO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒，其特征在于，包括：包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液、标准品、标准品稀释液、样本稀释液、浓缩洗涤液、发光液A和发光液B、检测抗体稀释液。/n

【技术特征摘要】
1.一种S100B蛋白的化学发光法检测试剂盒，其特征在于，包括：包被有抗S100B单克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液、标准品、标准品稀释液、样本稀释液、浓缩洗涤液、发光液A和发光液B、检测抗体稀释液。


2.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶标记的检测用抗S100多克隆抗体溶液通过如下方法制得：
抗体纯化、定量后，在0.01mol/L、pH＝9.0～9.5的碳酸盐缓冲溶液中透析，至浓度为5mg/mL；
配置5mg/mL的辣根过氧化物酶水溶液；
向所述辣根过氧化物酶水溶液中加入0.4mL浓度为37.5mg/mL的NaIO4，室温避光搅拌20min，得到氧化后的酶液；
将所述氧化后的酶液在1mmol/L、pH＝4.4、4℃的醋酸盐缓冲液透析过夜，换液3次；
取出透析袋中的溶液，加入0.2mol/LNa2CO3缓冲溶液，调至pH＝9.0-9.5，并迅速与纯化、定量后的抗体1:1混合，室温避光轻微搅拌2h；
加入6mg/mLNaBH4溶液100ul，混匀，4℃反应2h；
还原后的反应体系，于0.15mol/L、pH＝7.4PBS中4℃透析过夜，换液3次；
加入BSA使终浓度为2～3mg/mL，混匀，10000rpm×3min，收集上清，分装冻存。


3.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述标准品为S100B抗原。


4.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液的溶剂为20mmol/L、pH＝6.0的磷酸缓冲盐溶液，溶质及其在所述样本稀释液中的质量浓度如下：0.2％的明胶、0.2％的酪蛋白、150mmol/L的NaCl、0.01％的吐温-20、5％的蔗糖、0.5/万的溴钾酚紫以及0.1％的防腐剂。


5.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液的溶剂为水，溶质及其在所述浓缩洗涤液中的浓度为116g/L的Na2HPO4·12H2O、11.84g/LNaH2PO4·2H2O、180g/LNaCl、5mL/L吐温20以及1mL/L防腐剂。


6.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述发光液A的溶剂为pH＝8.0、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，溶质及其在所述发光液A中的浓度为3mg/mL的鲁米诺、0.25mg/mL的对碘苯酚以及0.5mg/mL的四苯硼钠。


7.如权利要求1所述的S100B蛋白的检测试剂盒，其特征在于，所述发光液B的溶剂为pH＝8.0、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，溶质及其在所述发光液B中的浓度为0.5mg/mL的过氧化脲。

【专利技术属性】
技术研发人员：赵京超，艾冰花，焉丽波，王立杰，常青侠，陈蒙蒙，
申请(专利权)人：艾维可生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37