本发明专利技术涉及一种用于富集mRNA的磁珠复合物及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一种用于富集mRNA的磁珠复合物，包括磁珠、间臂、引物以及oligodT，其中，引物通过间臂偶联在磁珠上，oligodT通过引物与间臂相连，间臂为C链和/或碱基T，引物用于扩增目标mRNA经过反转录后结合在磁珠上的cDNA，oligodT能够与目标mRNA特异性结合；所述用于富集mRNA的磁珠复合物在引物和磁珠之间设置了间臂，一方面，可以减少原位cDNA预扩增时的位阻效应，增强扩增的效率，另一方面，间臂使得利用所述磁珠复合物进行mRNA富集时，可以在有磁珠的情况下做反转录，同时也可以进行PCR扩增的反应。同时也可以进行PCR扩增的反应。同时也可以进行PCR扩增的反应。
【技术实现步骤摘要】
一种用于富集mRNA的磁珠复合物及其应用
[0001]本专利技术涉及一种用于富集mRNA的磁珠复合物及其应用，属于生物
技术介绍
[0002]单细胞转录组测序(scRNA seq)是近几年兴起的，以二代高通量测序平台以及生物信息学为基础的新生测序技术手段。相对于传统的转录组测序(bulk RNA
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seq)，其技术优势是可以在单细胞水平上，研究不同的细胞之间基因组、转录组以及表观遗传学的差异。转录组分析是将基因型与细胞表型联系起来的一种强有力的策略。
[0003]随着分子生物学技术的飞速发展，人们对转录组学的研究不再局限于群体细胞水平，而是精确到单细胞水平。众所周知，生物组织所具有的普遍特征是细胞异质性。常规的多细胞水平的转录组学的研究需要大量细胞，并且其研究结果反应的是群体细胞基因表达的平均值，而这个平均值掩盖了数量较少的细胞亚群的表达信息，因而难以区分群体细胞中不同细胞亚群的转录特征。
[0004]传统的bulk RNAseq在进行细胞研究时，通常需要数十万到数百万细胞当量的RNA作为模板进行测序(100ng～5μg)。单细胞中的RNA含量较低，通常仅10～20pg，大约合105～106个RNA分子，捕获、扩增和建库方法的技术难度也较传统组织样本的RNA建库要大得多。因此，单细胞转录组测序技术的创新和开发，在基础研究和临床应用都将会有巨大的研发价值。而在单细胞转录组测序时，获得高质量的mRNA，是进行后续反转录扩增建库实验步骤的前提，也是获得良好生物信息分析结果的基础。
技术实现思路
[0005]为解决上述问题，本专利技术提供了一种用于富集mRNA的磁珠复合物，所述用于富集mRNA的磁珠复合物包括磁珠、间臂、引物以及oligodT；所述引物通过间臂偶联在磁珠上；所述oligodT通过引物与间臂相连；所述间臂为C链和/或碱基T；所述引物用于扩增目标mRNA经过反转录后结合在磁珠上的cDNA；所述oligodT能够与目标mRNA特异性结合。
[0006]在本专利技术的一种实施方式中，所述目标mRNA是指单细胞/少量细胞转录组。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，所述富集是指对单细胞/少量细胞转录组进行捕获和扩增。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述间臂为长度2～30的碳链C和/或长度2～30的碱基T。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述间臂为长度6～12的碳链C或长度4～10的碱基T。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述磁珠为羧基磁珠。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述间臂通过末端修饰的NH2偶联到磁珠上。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述引物的长度为12～70个碱基。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述引物的长度为18～35个碱基。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述oligodT的长度为12～70个碱基T。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述oligodT的长度为15～35个碱基T。
[0016]本专利技术还提供了一种制备上述用于富集mRNA的磁珠复合物的方法，所述方法为：所述方法为：合成间臂、引物和oligodT，并将间臂、引物和oligodT依次相连，得到磁珠连接序列；将磁珠和磁珠连接序列混合后进行偶联反应，得到权利要求1～4任一项所述的用于富集mRNA的磁珠复合物。
[0017]本专利技术还提供了一种用于富集mRNA的试剂盒，所述试剂盒包含上述用于富集mRNA的磁珠复合物。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述试剂盒还包含裂解缓冲液；所述裂解缓冲液的成分包含1％Triton X
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100 2μL和4M盐酸胍/异硫氰酸胍2μL；或者，所述裂解缓冲液的成分包含1％Triton X
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100 2μL、40U/μL RNase inhibitor 0.1μL、2M LiCl 1μL和DEPC H2O 1μL；或者，所述裂解缓冲液的成分包含1％Triton X
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100 2μL、40U/μL RNase inhibitor 0.1μL、2M LiCl 0.5μL和DEPC H2O 1μL；或者，所述裂解缓冲液的成分包含1％Triton X
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100 2μL、40U/μL RNase inhibitor 0.1μL、2M LiCl 0.5μL、DEPC H2O 1μL和1％β巯基乙醇0.04μL；或者，所述裂解缓冲液的成分包含1％Triton X
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100 2μL、40U/μL RNase inhibitor 0.1μL、2M LiCl 0.5μL、DEPC H2O 1μL和1％二硫苏糖醇0.04μL。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述试剂盒还包含杂交缓冲液；所述杂交缓冲液为添加有1.0M LiCl、2mM EDTA、5mM DTT以及10％甲酰胺的20mM、pH 7.5的Tris
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HCl缓冲液。
[0020]本专利技术还提供了一种单细胞/少量细胞转录组扩增及测序方法，所述方法为：使用上述用于富集mRNA的磁珠复合物或上述用于富集mRNA的试剂盒对单细胞/少量细胞中的目标mRNA进行捕获和扩增，以实现对单细胞/少量细胞中目标mRNA的富集。
[0021]本专利技术还提供了上述用于富集mRNA的磁珠复合物或上述用于富集mRNA的试剂盒或上述单细胞/少量细胞转录组扩增及测序方法在单细胞/少量细胞转录组扩增及测序中的应用。
[0022]本专利技术技术方案，具有如下优点：
[0023]1、本专利技术提供了一种用于富集mRNA的磁珠复合物，所述用于富集mRNA的磁珠复合物包括磁珠、间臂、引物以及oligodT，其中，引物通过间臂偶联在磁珠上，oligodT通过引物与间臂相连，间臂为C链和/或碱基T，引物用于扩增目标mRNA经过反转录后结合在磁珠上的cDNA，oligodT能够与目标mRNA特异性结合；与传统的oligodT磁珠相比，所述用于富集mRNA的磁珠复合物在引物和磁珠之间设置了间臂，一方面，可以减少原位cDNA预扩增时的位阻效应，增强扩增的效率，另一方面，间臂使得利用所述磁珠复合物进行mRNA富集时，可以在有磁珠的情况下做反转录，同时也可以进行PCR扩增的反应，并且，通过接入间臂，polyA更容易与磁珠结合；
[0024]进一步地，所述用于富集mRNA的磁珠复合物可以用于富集单细胞/少量细胞mRNA，对于直接裂解效果不好的样本(有干扰物质和大量rRNA)，尤为有效，获取的mRNA可以进行单细胞和少量细胞转录组NGS测序，也可以用于特别基因表达水平的检测；由于反转录合成的cDNA附着在磁珠上，可以重复进行PCR扩增反应，从而可以保存样本的cDNA产物，用于以后研究；
[0025]进一步地，由于单细胞/少量细胞含有的mRNA量相对较少，使用所述用于富集mRNA
的磁珠复合物本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于富集mRNA的磁珠复合物，其特征在于，所述用于富集mRNA的磁珠复合物包括磁珠、间臂、引物以及oligodT；所述引物通过间臂偶联在磁珠上；所述oligodT通过引物与间臂相连；所述间臂为C链和/或碱基T；所述引物用于扩增目标mRNA经过反转录后结合在磁珠上的cDNA；所述oligodT能够与目标mRNA特异性结合。2.如权利要求1所述的用于富集mRNA的磁珠复合物，其特征在于，所述间臂为长度2～30的碳链C和/或长度2～30的碱基T。3.如权利要求1或2所述的用于富集mRNA的磁珠复合物，其特征在于，所述引物的长度为12～70个碱基。4.如权利要求1～3任一项所述的用于富集mRNA的磁珠复合物，其特征在于，所述oligodT的长度为12～70个碱基T。5.一种制备权利要求1～4任一项所述的用于富集mRNA的磁珠复合物的方法，其特征在于，所述方法为：合成间臂、引物和oligodT，并将间臂、引物和oligodT依次相连，得到磁珠连接序列；将磁珠和磁珠连接序列混合后进行偶联反应，得到权利要求1～4任一项所述的用于富集mRNA的磁珠复合物。6.一种用于富集mRNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～4任一项所述的用于富集mRNA的磁珠复合物。7.如权利要求6所述的用于富集mRNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含裂解缓冲液；所述裂解缓冲液的成分包含1％Triton X
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100 2μL和4M盐酸胍/异硫氰酸胍2μL；或者，所述裂解缓冲液的成分包含1％Triton X
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1002μL、40U/μL RNase inhibitor 0.1μL、2...
【专利技术属性】
技术研发人员：雍军，范静彦，包仁艳，
申请(专利权)人：苏州极客基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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