一株同时表达F4和F18菌毛的猪源大肠杆菌无毒分离株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株同时表达F4和F18菌毛的猪源大肠杆菌无毒分离株及其应用，所述猪源大肠杆菌无毒分离株F418的保藏编号为CCTCC M 2022089，保藏日期为2022年1月18日。本发明专利技术分离菌株为大肠杆菌，能同时表达F4和F18两种菌毛抗原，为猪源自然分离株，PCR测试表明该菌株缺乏LT和STb肠毒素基因，不产生肠毒素，能够良好地黏附定植于宿主猪，该菌株具有开发成细菌无毒活疫苗候选株的潜力，通过口服该毒株能够良好地黏附定植于宿主猪，诱导仔猪产生抗F4和F18两种菌毛抗原的免疫应答，发挥一定免疫效力，安全性具有保障，有望成为防控F4和F18大肠杆菌感染的潜在活疫苗候选株。杆菌感染的潜在活疫苗候选株。杆菌感染的潜在活疫苗候选株。

A nontoxic strain of E. coli from swine expressing both F4 and F18 fimbriae and its application

【技术实现步骤摘要】
一株同时表达F4和F18菌毛的猪源大肠杆菌无毒分离株及其应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一株同时表达F4和F18菌毛的猪源大肠杆菌无毒分离株F418及其应用。

技术介绍

[0002]新生或断奶仔猪腹泻造成全球生猪养殖的重大损失，其中产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是主要原因。猪源ETEC主要包括F4和F18两种血清型，可感染不同日龄的仔猪，导致仔猪黄痢、白痢、水肿病和断奶仔猪腹泻等疾病。据统计，ETEC引发的仔猪发病和死亡占仔猪总发病率和死亡率的56.2％和24.7％。
[0003]动物生产养殖针对ETEC的防控策略主要是应用抗生素，但在2020年国家出台“限抗”政策后，养殖过程的抗生素用量受限，猪ETEC感染率随之出现不断增长态势。此外，近年来新型的大肠杆菌耐药株不断出现，养殖生产中常用的抗生素类型均出现了相应的耐药菌株和多重耐药菌株，如β
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内酰胺类(阿莫西林、头孢噻呋)，氨基糖苷类(新霉素)，喹诺酮类(恩诺沙星)和酰胺醇类(氟苯尼考)等。2015年我国学者首次在猪大肠杆菌中发现了针对多黏菌素的mcr
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1耐药基因，打破了人类防控细菌的最后一道防线。因此，目前亟需新型有效的猪大肠杆菌病防控措施。
[0004]探究ETEC的感染机制有利于探寻科学合理的防控策略。ETEC的致病机制主要包括两个过程：首先ETEC F4或F18菌毛顶端的黏附素介导与猪小肠上皮细胞受体的结合，使细菌能够稳定地黏附定植在宿主体内。该黏附过程是建立感染的第一步，也是关键一步。黏附定植成功后ETEC F4产生的肠毒素产生毒理效应，导致动物发病：包括分泌热敏肠毒素(LT)和热稳定肠毒素(ST)至肠腔内，被猪肠道上皮细胞吸收后可导致动物电解质失衡，快速脱水并引发代谢性酸中毒，不及时救治的动物往往在12小时内死亡。综合上述背景，理想的活细菌疫苗候选株应当具备功能性的黏附抗原结构，能够稳定地黏附定植于宿主但不会产生毒素，不会引发疾病，且能够有效刺激宿主产生特异性免疫应答，产生的抗F4或F18菌毛特异性抗体能抵抗病原菌ETEC F4或F18的黏附定植。目前有报道利用野生株敲除肠毒素基因构建弱毒株，但这种基因修饰的缺失株定植能力弱，在体内不稳定，且容易被清除，虽然相对安全，但仍然具有一定的毒性。考虑LT和STb基因由质粒编码，质粒多拷贝数，人为敲除多拷贝基因和敲除的精准鉴定有一定难度，且敲除基因后存在再重组的可能性，从而导致毒力返强，这种基因缺失株安全性需要长期评估。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一株同时表达F4和F18菌毛的猪源大肠杆菌无毒分离株F418及其应用，该菌株不产生肠毒素，能够良好地定植于宿主，诱导仔猪产生特异性免疫应答，并且不会导致动物发病和死亡。
[0006]技术方案：本专利技术提供了一株同时表达F4和F18菌毛的猪源大肠杆菌无毒分离株
(Escherichia coli)F418，其特征在于，所述猪源大肠杆菌无毒分离株(Escherichia coli)F418保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022089，保藏日期为2022年1月18日，保藏地址为中国武汉。
[0007]其中，所述无毒分离株缺失LT和STb肠毒素基因，经血清型测试和PCR验证其同时表达F4和F18两种菌毛抗原，培养特性、生长和生化特征与表达大肠杆菌F4菌毛的标准参考菌株C83902和表达大肠杆菌F18ab菌毛的标准参考菌株E coli 107/86基本一致。
[0008]其中，所述猪源大肠杆菌无毒分离株F418分离于2019年4月16日采集5日龄断奶仔猪30份粪便样品，采集人刘家奇(手机号18805274420)，按照国家标准方法(GB4789.6
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2016)进行。分离后保存于50％甘油和50％LB培养基的混合液，置于在
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70℃超低温冰箱储存。细菌培养和复苏方法如下：从保存的菌种中挑取少量划线于LB或麦康凯培养基的固体平板，培养温度为37℃，其中在LB琼脂平板中，37℃培养后可形成黄白色圆形光滑菌落；在麦康凯琼脂平板中，37℃培养后可形成桃红色圆形菌落；经五种糖酵解试验、IMViC试验和肠杆菌细菌生化反应鉴定为大肠杆菌；之后挑取菌落于试管中，震荡培养。
[0009]其中，所述振荡培养条件为180r/min震荡培养至OD
600
为1时获得该菌株的新鲜菌液。
[0010]本
技术实现思路
还包括所述的同时表达F4和F18菌毛的猪源大肠杆菌无毒分离株(Escherichia coli)F418在制备检测抗原介导间接凝集试验中的载体中的应用或在制备检测抗体介导间接凝集试验中的载体中的应用。
[0011]其中，所述猪源大肠杆菌无毒分离株(Escherichia coli)F418与F4菌毛多克隆抗体、F18ab菌毛多克隆抗体和F18ac菌毛多克隆抗体均发生凝集，与K99菌毛多克隆抗体不发生凝集。
[0012]本
技术实现思路
还包括所述的同时表达F4和F18菌毛的猪源大肠杆菌无毒分离株(Escherichia coli)F418在制备大肠杆菌F4和F18菌毛的特异性抗体中的应用。
[0013]本
技术实现思路
还包括一种特异性抗体，所述特异性抗体是由所述的猪源大肠杆菌无毒分离株(Escherichia coli)F418免疫动物获得。
[0014]本
技术实现思路
还包括所述的同时表达F4和F18菌毛的猪源大肠杆菌无毒分离株(Escherichia coli)F418在制备防控F4和F18大肠杆菌感染的活疫苗中的应用。
[0015]本
技术实现思路
还包括一种防控F4和F18大肠杆菌感染的疫苗，所述疫苗包括权利要求1所述的猪源大肠杆菌无毒分离株(Escherichia coli)F418。
[0016]其中，所述疫苗包括但不仅限于口服疫苗等。
[0017]其中，所述的同时表达F4和F18菌毛的猪源大肠杆菌无毒分离株F418以1
×
108CFU，1
×
10
9 CFU和1
×
10
10 CFU灌胃5日龄仔猪3只，经过10天观察，不会导致上述3只仔猪发病和死亡；病理学检测结果表明F418感染组仔猪十二指肠、空肠和回肠黏膜结构完整，肠绒毛纤长，无明显病理变化，与对照组仔猪的病理学检查结果一致。
[0018]其中，所述的同时表达F4和F18菌毛的猪源大肠杆菌无毒分离株能够黏附定植于仔猪肠道，且能诱导仔猪产生针对大肠杆菌F4和F18菌毛的特异性抗体，第7天产生抗F4和F18菌毛的凝集抗体滴度均为1∶2，第14天的抗体滴度均为1∶4，第21天的抗体滴度均为1∶4和1∶8之间，第28天的抗体滴度均为1∶8，随后抗体效价进一步缓慢升高，第42天针对大肠杆菌F4和F18菌毛的特异性抗体滴度分别为1∶8和1∶16之间。
[0019]本专利技术按照国家标准方法(GB 4789.6<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株同时表达F4和F18菌毛的猪源大肠杆菌无毒分离株（Escherichia coli）F418，其特征在于，所述猪源大肠杆菌无毒分离株（Escherichia coli）F418保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2022089，保藏日期为2022年1月18日。2.根据权利要求1所述的同时表达F4和F18菌毛的猪源大肠杆菌无毒分离株，其特征在于，所述无毒分离株缺失LT和STb肠毒素基因。3.权利要求1或2所述的同时表达F4和F18菌毛的猪源大肠杆菌无毒分离株（Escherichia coli）F418的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：从保存的菌种（Escherichia coli）F418中挑取少量划线于LB或麦康凯培养基的固体平板，培养温度为37℃，其中在LB琼脂平板中，37℃培养后可形成黄白色圆形光滑菌落；在麦康凯琼脂平板中，37℃培养后可形成桃红色圆形菌落。4.权利要求1或2所述的同时表达F4和F18菌毛的猪源大肠杆菌无毒分离株（Escherichia coli）F418在制备检测抗原介导间接凝集试验中的载体中的应用或在制备检...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱国强，刘家奇，张晓洁，段强德，武琥琮，权国梅，连思琪，羊扬，夏芃芃，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：