一种全基因组羟甲基化转化试剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种全基因组羟甲基化转化试剂及其应用，所述试剂包括氧化剂和还原剂，所述氧化剂包括金属氧化物，所述还原剂包括2

A genome-wide hydroxymethylation transformation reagent and its application

【技术实现步骤摘要】
一种全基因组羟甲基化转化试剂及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种全基因组羟甲基化转化试剂及其应用。

技术介绍

[0002]DNA甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰形式，研究表明DNA甲基化与癌症之间有非常密切的联系，可以将其作为肿瘤早期诊断和预后评价的重要指标。过去认为，哺乳动物DNA甲基化非常稳定，但越来越多的研究表明这一过程是动态可逆的。因此，近十几年来人们致力寻找DNA甲基化的逆反应，即直接将DNA去甲基化，但未能成功。而第六种碱基5
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羟甲基胞嘧啶(5
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hydroxy
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methylcytosine，5hmC)的发现为DNA去甲基化研究提供了新的思路。目前，相关的分析检测与测序技术快速发展，大大促进了人们对5hmC的探索研究以及对相关的生物学功能的认识。大量的研究显示5hmC是5mC在去甲基化过程中的一种重要的中间体，实际上，基因组中5hmC含量较低，这与其是一种短暂产生的中间体的推断是相一致的。虽然，5hmC的生物学功能还不是很明确，但是可以明确的是5hmC和TETs(ten
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eleven translocation蛋白)在全基因组的表观遗传重组和组织特异性基因表达的调控中起到了非常重要的作用。在复杂的生理过程中要深入研究5hmC的生物学功能，最关键的就是准确而高通量的对其进行定位，并且能够进一步对不同组织基因组DNA中的5hmC进行定量。
[0003]得益于DNA测序技术的蓬勃发展，DNA甲基化测序技术得到了突破性进展。DNA甲基化测序实质上是通过重亚硫酸盐反应，将含有修饰位点的测序转化为正常DNA测序的过程。首先，对待测基因组DNA进行重亚硫酸盐处理，未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶不发生变化，然后进行PCR扩增，克隆到载体后，可采用一般的DNA测序技术测序，包括下一代DNA测序技术和单分子DNA测序技术。通过与未处理基因组DNA的序列进行比对，判断基因组DNA的甲基化位点及覆盖程度。但是，经典的重亚硫酸盐测序法也不能区分5mC和5hmC。经重亚硫酸盐处理后，未甲基化的胞嘧啶可通过脱氨基和脱磺酸基作用转化为尿嘧啶，再经PCR扩增转变成T，而5mC经处理后不能转化为胞嘧啶C，PCR扩增后仍为C，从而可将5mC与未修饰的C区分。但5hmC由于不能脱氨基而形成5
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亚甲基磺酸胞嘧啶(5
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methylenesμL
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phonate，CMS)。因此，在重亚硫酸盐测序中5hmC和5mC都不能脱氨基，从而PCR扩增后二者不能产生序列差异，即5mC和5hmC不能被区分。另外，在PCR过程中CMS还具有抑制DNA聚合酶的效果。并且，重亚硫酸盐处理后的DNA损伤大，建好的文库中AT占比＞80％，碱基严重不平衡，上机检测需要混合其他全基因组文库进行测序，操作不便。所以，需要开发针对5hmC的检测方法，从而达到单碱基分辨率的测序效果。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种全基因组羟甲基化转化试剂，可特异性地识别并转换5hmC，即只将羟甲基化修饰的胞嘧啶转换成胸腺嘧啶。
[0005]本专利技术还提出一种具有上述全基因组羟甲基化转化试剂的试剂盒。
[0006]本专利技术还提出一种上述全基因组羟甲基化转化试剂和上述试剂盒的应用。
[0007]根据本专利技术的一个方面，提出了一种全基因组羟甲基化转化试剂，所述试剂包括氧化剂和还原剂，所述氧化剂包括金属氧化物，所述还原剂包括2
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甲基吡啶硼烷，所述氧化剂可特异性地识别并转换5hmC，并将5hmC氧化成5
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甲酰基胞嘧啶(5fC)，所述还原剂可将5
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甲酰基胞嘧啶(5fC)还原为二氢尿嘧啶(DHU)，PCR扩增时将DHU当做“T”，从而实现转化目的。
[0008]在本专利技术的一些实施方式中，所述全基因组羟甲基化转化试剂将5
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羟甲基胞嘧啶转化为胸腺嘧啶。
[0009]在本专利技术的一些实施方式中，所述金属氧化物为钌酸盐氧化剂、MnO2、KMnO4中的至少一种。
[0010]在本专利技术的一些实施方式中，所述钌酸盐氧化剂为K2RuO4。
[0011]在本专利技术的一些实施方式中，所述氧化剂还包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化镁和氢氧化钙的一种。采用含氢氧根的强碱性物质，在强碱性环境下，双链DNA解旋，但不涉及磷酸二酯键的断裂，其一级结构(碱基顺序)保持不变。
[0012]在本专利技术的一些实施方式中，所述还原剂还包括乙酸钠缓冲溶液，作为促进2
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甲基吡啶硼烷进行底物还原的反应缓冲体系。
[0013]在本专利技术的第二方面，提出了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述全基因组羟甲基化转化试剂。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂盒还包括阳性标准品。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，所述阳性标准品为SEQ ID NO.1所示序列。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂。
[0017]在本专利技术的一些实施方式中，所述PCR扩增试剂包含DNA聚合酶。
[0018]在本专利技术的第三方面，提出了上述全基因组羟甲基化转化试剂和上述试剂盒的应用，所述应用为在全基因组羟甲基化测序、DNA羟甲基化测序或靶向区域DNA羟甲基化测序中的用途。
[0019]在本专利技术的第四方面，提出了一种全基因组羟甲基化测序文库的构建方法，包括使用上述试剂或试剂盒将5
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羟甲基胞嘧啶转化为胸腺嘧啶。
[0020]在本专利技术的一些实施方式中，所述方法包括以下步骤：
[0021]S1、片段化DNA；
[0022]S2、片段化DNA末端修复加A；
[0023]S3、加A产物加接头得到加接头的DNA文库；
[0024]S4、将加接头的DNA文库进行氧化，得到氧化的DNA文库；
[0025]S5、将氧化的DNA文库进行还原得到还原的DNA文库；
[0026]S6、将还原后的DNA文库进行PCR扩增得到最终文库DNA。
[0027]在本专利技术的一些实施方式中，所述方法包括将待从5
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羟甲基胞嘧啶到胸腺嘧啶转化的DNA文库进行氧化反应的步骤，所述步骤包括：将氧化反应体系与氧化剂混合进行氧化反应；
[0028]以48.5μL为计，所述氧化反应体系如下：
[0029]DNA文库，80
‑
120ng；
[0030]1M NaOH，1.5
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3μL；
[0031]1×
SSC，补足至48.5μL。
[0032]在本专利技术的一些实施方式中，在DNA文库进行氧化反应的步骤中，反应条件为：将氧化反应体系于35
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40℃，300
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种全基因组羟甲基化转化试剂，其特征在于，所述试剂包括氧化剂和还原剂，所述氧化剂包括金属氧化物，所述还原剂包括2
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甲基吡啶硼烷。2.根据权利要求1所述的全基因组羟甲基化转化试剂，其特征在于，所述金属氧化物为钌酸盐氧化剂、MnO2、KMnO4中的至少一种。3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1
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2任一项所述的全基因组羟甲基化转化试剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性标准品。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性标准品为如SEQ ID NO.1所示序列。6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR扩增试剂；优选地，所述PCR扩增试剂包含DNA聚合酶。7.权利要求1或2所述的全基因组羟甲基化转化试剂或权利要求3
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6任一项所述的试剂盒在全基...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱碧银，王琳燕，陈香，王煜，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：