一种胆管癌淋巴结转移动物模型及其构建方法技术

本发明专利技术提供一种胆管癌淋巴结转移动物模型及其构建方法。该构建方法包括以下步骤：(1)对胆管癌细胞进行体外培养；(2)利用胰酶对胆管癌细胞进行消化；(3)利用PBS缓冲液稀释胆管癌细胞至浓度为1～2

【技术实现步骤摘要】
一种胆管癌淋巴结转移动物模型及其构建方法


[0001]本专利技术涉及动物模型构建
，具体涉及一种胆管癌淋巴结转移动物模型及其构建方法。

技术介绍

[0002]胆管癌是发病率仅次于肝细胞癌的肝胆系肿瘤，根据其解剖位置可分为肝内胆管癌、肛门部胆管癌、远端胆管癌。胆管癌的起病隐匿，大多数在进展期被发现，从而导致手术切除困难、根治性切除比例低、术后复发率高，使得胆管癌患者的最终预后很差，其5年生存率不足20％。这三种类型的胆管癌在生物学特性上有较大差异，但在大样本的人群分析中，R1/R2切缘、淋巴结转移、微血管侵犯是这几种胆管癌共同的预后危险因素。大多数胆管癌患者对当前的标准化疗方案(吉西他滨和顺铂)不敏感，且缺乏有效的靶向药物，根治性手术切除目前仍是胆管癌最有效的治疗方式，但大多数胆管癌患者确诊较晚，大约75％的患者有手术机会，且只有约70％接受手术的患者可以获得根治性切除。
[0003]已有多个独立的大样本研究发现，无论是否实现了R0切除，淋巴结转移都是重要的不良预后因素。日本名古屋大学通过研究发现，经过根治性切除后，无淋巴结转移的胆管癌患者5年生存率可达67.1％，而有淋巴结转移的胆管癌患者5年生存率只有22.1％。换而言之，淋巴结转移是导致胆管癌预后差的关键因素，而淋巴结转移灶可能成为远处转移的“跳板”，这说明淋巴结转移是影响胆管癌患者综合治疗的关键因素。
[0004]在肿瘤转移的多步骤中，肿瘤增殖、侵入脉管并通过循环达到远处器官是重要的起始步骤，若肿瘤未完成这些步骤则不会最终完成远处转移，故前期研究通常关注于肿瘤细胞或间质细胞对其转移的驱动作用，而忽视了肿瘤细胞是如何在与原发灶差异较大的转移灶微环境中存活下来的。
[0005]胆管癌细胞在完成了转移的绝大多数步骤后，若不能适应新的转移灶微环境并存活下来，胆管癌细胞将不能在转移灶中增值，从而导致转移失败，因此，研究胆管癌是如何适应并影响转移灶微环境的潜在机制，同样有重大的临床意义。目前，我们对淋巴结转移性胆管癌患者(约占30～45％)并无有效的治疗方法，且对胆管癌淋巴结转移的机制知之甚少，这在一定程度上限制了对淋巴结转移性胆管癌的发病机理以及治疗方法的深入研究。因此，构建一个可靠的、可直接用于研究胆管癌适应并影响淋巴结微环境的动物模型，将为转移性胆管癌的研究提供重要科学依据。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种胆管癌淋巴结转移动物模型及其构建方法，通过微量注射直接将胆管癌细胞接种至免疫缺陷动物的腹股沟淋巴结，成功构建了胆管癌淋巴结转移动物模型，为转移性胆管癌的研究提供了重要的科学依据。
[0007]根据本专利技术的第一个方面，提供一种胆管癌淋巴结转移动物模型的构建方法，包括以下步骤：
[0008](1)对胆管癌细胞进行体外培养；
[0009](2)利用胰酶对胆管癌细胞进行消化；
[0010](3)利用PBS缓冲液稀释胆管癌细胞至浓度为1～2
×
105个/μL；
[0011](4)将5～10μL稀释后的胆管癌细胞注射至免疫缺陷动物的腹股沟淋巴结，得到胆管癌淋巴结转移动物模型。
[0012]胆管癌转移灶中的微环境与胆管癌原发灶的微环境存在较大的差异性，因此，从胆管癌在原发灶发生转移的开始，胆管癌在向远处器官或者淋巴结转移的过程中，胆管癌细胞需要逐渐适应转移灶微环境才能存活下来。本专利技术提供了一种胆管癌淋巴结转移动物模型的构建方法，出于对免疫缺陷动物的腹股沟淋巴结的空间容量大小进行考虑，由于免疫缺陷动物的腹股沟淋巴结的容量较小，本专利技术采用微量注射的方式将少量胆管癌细胞直接注射至免疫缺陷动物的腹股沟淋巴结，使得胆管癌细胞能够在淋巴结进行良好的增殖和适应过程，能够更好地模拟胆管癌淋巴结转移灶，成功构建了胆管癌淋巴结转移动物模型。与胆管癌原位注射相比，本专利技术直接在免疫缺陷动物的腹股沟淋巴结(相当于胆管癌淋巴结转移灶)中直接注射胆管癌细胞，胆管癌细胞能够适应淋巴结腹股沟淋巴结的微环境并存活下来，且能够进行进一步的增殖，利用本专利技术提供的方法能够成功构建胆管癌淋巴结转移动物模型。该模型可应用于胆管癌淋巴结转移的机制研究，利用该模型探究胆管癌如何在淋巴结中存活并影响其微环境，有助于完善淋巴结转移性晚期胆管癌患者的治疗策略，对改善预后和生存质量具有重要的临床意义。
[0013]优选地，在步骤(1)中，体外培养采用RPMI
‑
1640完全培养基。
[0014]优选地，RPMI
‑
1640完全培养基为含有10vt％BSA、1vt％双抗的RPMI
‑
1640基础培养基。
[0015]优选地，双抗为青霉素+链霉素。
[0016]优选地，在步骤(2)中，胰酶的浓度为0.25vt％。
[0017]优选地，在步骤(4)中，免疫缺陷动物为重度免疫缺陷NOD/Scid小鼠。
[0018]本方案采用的免疫缺陷动物为重度免疫缺陷NOD/Scid小鼠，能够排除T细胞、B细胞、NK细胞等免疫细胞及相关细胞因子的干扰，能够单纯研究胆管癌如何适应与原发灶微环境差异显著、富含脂质等代谢物的淋巴结微环境。
[0019]优选地，上述步骤(4)具体包括以下过程：
[0020]S1、在无菌条件下，将重度免疫缺陷NOD/Scid小鼠麻醉，固定、备皮、打开腹腔；
[0021]S2、对重度免疫缺陷NOD/Scid小鼠的腹股沟淋巴结的解剖学位置进行定位；
[0022]S3、将胆管癌细胞注射至腹股沟淋巴结，退针，关腹、缝合、消毒，得到胆管癌淋巴结转移动物模型。
[0023]与用于研究肿瘤淋巴结转移的驱动因素的足垫注射动物模型的构建方法相比，本方案对重度免疫缺陷NOD/Scid小鼠进行麻醉后，能够更好地对其进行固定，且基于重度免疫缺陷NOD/Scid小鼠的解剖学特征，能够对重度免疫缺陷NOD/Scid小鼠的腹股沟淋巴结进行准确定位，通过精细手术和微量注射直接将胆管癌细胞接种至重度免疫缺陷NOD/Scid小鼠的腹股沟淋巴结，以构建胆管癌淋巴结转移灶，克服了在体外完全难以模拟淋巴结微环境的难题，为研究胆管癌如何适应淋巴结微环境及探究胆管癌淋巴结转移的干预靶点提供新的模型。
[0024]优选地，在S1中，所述麻醉的具体操作如下：使用1.5～3vt％异氟烷对重度免疫缺陷NOD/Scid小鼠进行诱导麻醉，然后通过腹腔注射1vt％戊巴比妥钠溶液进行全身麻醉，并在手术期间使用1～1.5vt％异氟烷维持麻醉，固定，备皮，切开腹腔。
[0025]优选地，备皮面积为2
×
2cm2。
[0026]优选地，在诱导麻醉中，氧气的流速为0.4～0.6L/min。
[0027]优选地，在诱导麻醉中，氧气的流速为0.6L/min。
[0028]优选地，在维持麻醉中，氧气的流速为0.4～0.6L/min。
[0029]优选地，在维持麻醉中，氧气的流速为0.6L/min。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胆管癌淋巴结转移动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)对胆管癌细胞进行体外培养；(2)利用胰酶对所述胆管癌细胞进行消化；(3)利用PBS缓冲液稀释所述胆管癌细胞至浓度为1～2
×
105个/μL；(4)将5～10μL稀释后的所述胆管癌细胞注射至免疫缺陷动物的腹股沟淋巴结，得到所述胆管癌淋巴结转移动物模型。2.如权利要求1所述胆管癌淋巴结转移动物模型的构建方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，所述体外培养采用RPMI
‑
1640完全培养基，所述RPMI
‑
1640完全培养基为含有10vt％BSA、1vt％双抗的RPMI
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1640基础培养基；所述双抗为青霉素+链霉素。3.如权利要求1所述胆管癌淋巴结转移动物模型的构建方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，所述胰酶的浓度为0.25vt％。4.如权利要求1所述胆管癌淋巴结转移动物模型的构建方法，其特征在于：在所述步骤(4)中，所述免疫缺陷动物为重度免疫缺陷NOD/Scid小鼠。5.如权利要求4所述胆管癌淋巴结转移动物模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括以下过程：S1、在无菌条件下，将所述重度免疫缺陷NOD/S...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘超，张洪华，许磊波，朱柯，周子钰，林书盛，杨彩妮，宋之潇，
申请(专利权)人：中山大学孙逸仙纪念医院，
类型：发明
国别省市：