【技术实现步骤摘要】
一种MTX耐药肿瘤细胞的高置信断裂点筛选方法
[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种MTX耐药肿瘤细胞的高置信断裂点筛选方法。
技术介绍
[0002]基因组结构变异指的是染色体结构的异常，是基因组变异的一种重要类型。SV可以促进人类基因组的进化和各种疾病的发生，并且SV在不同类型的癌症中也非常普遍。同时，高频率复发的体细胞SV也是药物靶向的理想选择。通过分析研究人类SV可以确定与疾病相关联的基因、断裂重组热点、亲缘倾向及突变机制，揭示形成SV的关键因素及遗传疾病的关键基因。
[0003]二代测序可以从基因组随机片段拷贝中平行地对大量的短DNA链进行测序，并且具有通量高、成本低、耗时少、速度快、劳动强度低等特点。当NGS应用于整个人类基因组时，称为全基因组测序。由于WGS能够在全基因组范围内为SV的发现提供多维信息，因此WGS已成为近年来研究SV的主要手段。
[0004]但是，利用WGS来研究SV时，真正限制的是基于WGS数据的SV检测程序，比如不同的软件调取SV断裂点是有优劣趋势的，WGS运行生...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种MTX耐药肿瘤细胞的高置信断裂点筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：首先，将人结肠癌细胞系HT29用浓度梯度递增的MTX进行连续培养，待每个浓度梯度细胞对相应药物浓度耐受后，继续培养5个月直至其稳定耐药后，继续后续实验，HT29亲本及耐药细胞在含15％胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，耐药细胞系培养基中添加相应浓度的MTX，所有细胞均培养在5％CO2、37℃恒温细胞培养箱中；S2：取数量不超过5
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106的生长情况良好的细胞，PBS冲洗3次、胰酶消化并用培养基制备细胞悬液，1000转/分离心5分钟，弃掉上清并用PBS冲洗沉淀，再次离心，弃上清得到细胞沉淀，将细胞沉淀弹开并加入200μl PBS、20μl蛋白酶K和200μl Buffer AL混匀后56℃水浴10分钟，随后加入200μl无水乙醇，涡旋混匀，将液体吸出并加入到QIAmp mini离心柱中，8000转/分离心1分钟后更换收集管，向柱子中加入500μl Buffer AW1离心后更换收集管，条件同上，再加入500μl Buffer AW2,14000转/分全速离心3分钟，将柱子转移至新的1.5ml Eppendorf管中，加适量Buffer AE，室温孵育3分钟后8000转/分离心1分钟，Eppendorf管中离心得到的液体即为基因组DNA，测定DNA浓度并统一配平至50ng/μl；S3：联合应用DELLY(版本0.7.6)、LUMPY(版本0.2.13)和CREST共同调取人结肠癌HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系全基因组测序数据中的SV(缺失、重复、倒位、插入、易位)，通过DELLY和LUMPY，分别确定每个样本中所有结构变异的起始位置、终止位置以及支持的对端(pair
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ends，PE)读取数和拆分读取(split reads，SR)数。通过CREST，除起始位置和终止位置外，还获得了左/右软剪切读取数(left/right soft
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clipped reads，LeftSclip/RightSclip)，利用每个结构变异断裂点的起始位置，设定具体阈值，将所有样本中断裂点分为高置信、中置信和低置信断裂点；筛选的标准及流程如下：高置信断裂点的筛选标准为由三个软件同步检测到的断裂点或在两个软件中检测到的断裂点(DELLY和LUMPY中的PE&SR，CREST中的LeftSclip&RightSclip必须全部大于或等于10)。中置信断裂点必须由两个软件检测到，PE、SR、LeftSclip、RightSclip中至少有一个大于等于10，但不包括均大于等于10。低置信断裂点同样由两个软件检测到，且PE、SR、LeftSclip、RightSclip均小于10。S4：通过以上筛选流程，我们获得了HT29亲本及18个MTX梯度耐药细胞系的全部高置信、中置信、低置信断裂点集，并将所获得的全部断裂点按照前述5号染色体区域进行划分；S5：最后，通过PCR、琼脂糖凝胶电泳及Sanger测序验证DMs区域内全部断裂点、HSRs区域内全部高置信断裂点的准确性。2.根据权利要求1所述的一种MTX耐药肿瘤细胞的高置信断裂点筛选方法，其特征在于，所述高置信断裂点为联合应用DELLY、...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋盈，孟祥宁，蔡梦迪，肖云，傅松滨，冯犇，王利强，关荣伟，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：
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