稳定表达培美曲塞耐药性人肺腺癌细胞株的构建方法技术

本发明专利技术涉及稳定表达培美曲塞耐药性人肺腺癌细胞株的构建方法，构建方法包含培美曲塞以顺浓度变化的方式培养所述人肺腺癌细胞株，得到能够稳定传代的，且具有所述培美曲塞耐药性的所述人肺腺癌细胞株。本发明专利技术确立了一种新的筛选耐药细胞株的方法，对比传统的高浓度反复间歇法和低浓度长期刺激法，本方法中涉及的步骤简单且筛选时间固定。本方法采用顺浓度的药物筛选方法，通过高浓度的刺激变化至低浓度的耐药保存，从而能够得到稳定耐药的细胞株。从而能够得到稳定耐药的细胞株。从而能够得到稳定耐药的细胞株。

【技术实现步骤摘要】
稳定表达培美曲塞耐药性人肺腺癌细胞株的构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种用于研究相关耐药机制的工具细胞筛选方法及其应用。

技术介绍

[0002]肺癌是全球发病率和死亡率增长最快的恶性肿瘤之一，占到我国男性肿瘤发病率的第1位和女性肿瘤发病率的第2位。肺癌主要分为非小细胞肺癌(NSCLC，约85％)和小细胞肺癌(SCLC，约15％)。NSCLC根据组织病理学类型又可分为肺腺癌(lung adenocarcinoma)、鳞状细胞癌、腺鳞癌、大细胞癌及肉瘤样癌等亚型。肺腺癌发病率逐年增长，已经成为NSCLC中最常见的亚型，几乎占全部肺癌的50％，且总体生存率较低。
[0003]培美曲塞作为一种常用的多靶点抗代谢药物，常用于肺癌的治疗。例如，专利号为CN109806393A的中国专利涉及一种抗PD
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1抗体联合培美曲塞和铂类药物在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的用途。具体而言，本专利技术涉及一种抗PD
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1抗体联合培美曲塞和卡铂在制备治疗非小细胞肺癌的药物中的用途，抗PD
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1抗体联合培美曲塞和卡铂相比于培美曲塞和卡铂显示出良好的抗肿瘤疗效。但在治疗过程中癌细胞对药物(例如，培美曲塞)刺激产生的耐药性，是降低治疗效果，导致患者病情恶化的重要原因之一。
[0004]专利号为CN110669844A的中国专利公开了一种用于检测培美曲塞+顺铂治疗适用性的试剂盒，其包括：has
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miR
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6077检测体系，记载用于确定has
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6077表达量高/低分界标准的数学模型的载体，当生物样本中hsa
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miR
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6077表达量不高于所述标准时，提示患者对培美曲塞+顺铂治疗敏感；反之当高于所述标准时，提示患者对培美曲塞+顺铂治疗不敏感。本专利技术的试剂盒能够用于判断肺腺癌患者是否适合采用培美曲塞+顺铂联合治疗方案，从而实现精准医疗。该方法通过个体的独立测试实现药物治疗的效率提高。
[0005]进一步地，专利号为CN113189219A的中国专利公开了基于代谢组学预测培美曲塞化疗疗效的方法，包括如下步骤：S1：病患的入选以及排除；S2：样本采集；S3：样本检测；S4：疗效评价；基于代谢组学预测培美曲塞化疗不良反应的方法，包括如下步骤：S1：筛选最佳代谢物组合；S2：建立预测模型，本专利技术检测并确认了代谢产物，同时以此建立一种预测化疗后的疗效模型，能够预测培美曲塞铂类双药治疗非小细胞肺癌的疗效，同时建立了血液不良反应预测模型以及肝脏不良反应预测模型，能够有效确定培美曲塞铂类双药治疗产生的不良反应以及副作用，进而达到疗效的最优化以及不良反应以及副作用的最小化。通过代谢组学进行药物疗效和预后的预测，但预测的结果具有很大误判风险。针对病情发展较快的癌症而言，误判结果而错误使用药物带来的时间风险是患者无法承受的。
[0006]为了找到促使非耐药肿瘤向耐药肿瘤细胞转化的关键因素，需要稳定的耐药细胞株作为研究工具。基于此，本专利技术设计一种能够筛选稳定表达耐药性细胞株的方法，从而得到用于耐药性研究的且能够稳定传代的细胞株，从而使药物在研发阶段即能够在最大程度减少患者使用的耐药性，并满足研究人员对各类的耐药细胞的表达水平或生物通路进行针对性研究。
[0007]此外，一方面由于对本领域技术人员的理解存在差异；另一方面由于申请人做出本专利技术时研究了大量文献和专利，但篇幅所限并未详细罗列所有的细节与内容，然而这绝非本专利技术不具备这些现有技术的特征，相反本专利技术已经具备现有技术的所有特征，而且申请人保留在
技术介绍
中增加相关现有技术之权利。

技术实现思路

[0008]针对现有技术之不足，本专利技术提供了一种用于研究相关耐药机制的工具细胞筛选方法及其应用。
[0009]筛选方法包含以下步骤：
[0010]检测A549细胞的半数抑制浓度；
[0011]将A549细胞分为筛选组和对照组两组，并分别以相同的培养条件培养至A549细胞铺盖培养设备的底面积半数以上，筛选组加入培美曲塞(第一刺激浓度)进行刺激，对照组则加入等体积缓冲液；
[0012]在观察到有A549细胞开始死亡后，将培美曲塞的刺激浓度降低为第二刺激浓度，重复刺激&恢复培养操作，并保持对细胞状态的观察；
[0013]当A549细胞出现半数以上死亡后继续下调刺激浓度，使培养环境中的培美曲塞达到第三刺激浓度，培养细胞进行细胞传代至铺满培养瓶至少半数底面积，培养期间持续添加培美曲塞使培养环境中培美曲塞的浓度保持第三刺激浓度；
[0014]停止添加培美曲塞，检测并对比筛选组与对照组中可传代的细胞对培美曲塞的敏感性；
[0015]当筛选组A549细胞在停药后依然存在对培美曲塞的耐药性时，即获得了存在于筛选组内的已经转化为稳定的A549培美曲塞耐药细胞株。
[0016]半数抑制浓度是指能引起受试生物的某种效应50％抑制的浓度。半数抑制浓度与实验生物种类、实验时间有关，可以用不同时间的抑制浓度来表示。用来确定半数抑制浓度的实验生物要有明显的反应特征，便于判断，如反应迟钝、运动能力降低，或有其他的生理、行为受到明显的抑制。半数抑制浓度与半数效应浓度一样可比较快速地判断被试物质对受试生物可能产生的影响，为进一步做急性毒性或慢性毒性研究提供参考。因此，本专利技术通过检测A549细胞的半数抑制浓度来确定A549细胞的培美曲塞的第一刺激浓度。
[0017]根据一种优选实施方式，本专利技术涉及一种用于研究相关耐药机制的工具细胞筛选方法，其主要采用顺浓度的药物刺激方式培养工具细胞，从而得到用于耐药机制研究的耐药细胞株系。
[0018]根据一种优选实施方式，A549细胞的半数抑制浓度能够通过CCK
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8法检测获取。
[0019]根据一种优选实施方式，培美曲塞顺浓度变化至少包含第一刺激浓度、第二刺激浓度和第三刺激浓度三个浓度梯度，使人肺腺癌细胞株至少经历三个具有浓度差的培美曲塞刺激阶段，从而获取稳定表达的培美曲塞耐药性人肺腺癌细胞株。进一步地，培美曲塞的第一刺激浓度能够大于人肺腺癌细胞株的半数抑制浓度，从而使培美曲塞的第一刺激浓度能够对人肺腺癌细胞株产生耐药刺激作用。
[0020]根据一种优选实施方式，第一刺激浓度能够高于第二刺激浓度，第二刺激浓度能够高于第三刺激浓度，即A549细胞的刺激浓度能够为顺浓度梯度变化。优选地，培美曲塞以
顺浓度变化的方式培养人肺腺癌细胞株，得到能够稳定传代的，且具有培美曲塞耐药性的所述人肺腺癌细胞株。
[0021]根据一种优选实施方式，第一刺激浓度与第二刺激浓度的浓度差倍数和第二刺激浓度与第三刺激浓度的浓度差倍数相同。
[0022]根据一种优选实施方式，第一刺激浓度与第二刺激浓度的浓度差倍数和第二刺激浓度与第三刺激浓度的浓度差倍数不同。
[0023]根据一种优选实施方式，第一刺本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.稳定表达培美曲塞耐药性人肺腺癌细胞株的构建方法，其特征在于，所述培美曲塞以顺浓度变化的方式培养所述人肺腺癌细胞株，得到能够稳定传代的，且具有所述培美曲塞耐药性的所述人肺腺癌细胞株。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述培美曲塞顺浓度变化阶段至少包含第一刺激浓度、第二刺激浓度和第三刺激浓度三个浓度梯度，使人肺腺癌细胞株至少经历三个具有浓度差的培美曲塞刺激阶段，从而获取稳定表达的培美曲塞耐药性人肺腺癌细胞株。3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述培美曲塞的第一刺激浓度能够大于所述人肺腺癌细胞株的半数抑制浓度，从而使所述培美曲塞的第一刺激浓度能够对所述人肺腺癌细胞株产生耐药刺激作用。4.根据权利要求1～3任一项所述的构建方法，其特征在于，所述第一刺激浓度与所述第二刺激浓度的浓度差倍数和所述第二刺激浓度与所述第三刺激浓度的浓度差倍数相同。5.根据权利要求1～3任一项所述的构建方法，其特征在于，所述第一刺激浓度与所述第二刺激浓度的浓度差倍数和所述第二刺激浓度与所述第三刺激浓度的浓度差倍数不同。6.根据权利要求1～5任一项所述的构建方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宏权，许思迪，贺慧颖，战军，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：