一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法和应用技术

本申请实施例提供了一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法，包括以下步骤：提供含有微纳米生物活性物质的待测样品；用含DNA探针的第一缓冲溶液对所述待测样品进行预处理后，转移至含有第一茎环结构链的第二缓冲溶液中，得到第一溶液；使用微液滴生成装置，将第一溶液形成油包水微液滴，每个所述油包水微液滴均注入有等量含第二茎环结构链的第三缓冲溶液，收集所述油包水微液滴，经恒温培养后，所述含有所述微纳米生物活性物质的油包水微液滴固化形成水凝胶微胶囊；过膜处理，收集所述水凝胶微胶囊，以实现对所述微纳米生物活性物质分离捕获。该方法简单、高效，有效保留微纳米生物活性物质的高生物活性。本申请还提供了该方法的应用。的应用。的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法和应用


[0001]本申请涉及生物医学
，特别是涉及一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法和应用。

技术介绍

[0002]CTC(Circulating Tumor Cell,循环肿瘤细胞)是进入人体外周血的肿瘤细胞的通称。研究表明，CTC在导致超过90％的癌症相关的死亡的肿瘤细胞恶性转移过程中均扮演着重要角色，因此，CTC被认为是一种非常具有潜力的标志物，对癌症诊断、病情预测和治疗效果评估都发挥重要作用。目前，对于一些小尺寸的生物活性物质(例如CTC)的高效分离捕获还没有一种有效的方法。像通过流式细胞仪分选或激光捕获显微切割技术等方法对CTC的分离，存在设备笨重且操作流程复杂的问题，大大影响CTC的生物活性。传统微流控技术分离CTC过程中又容易对细胞造成损伤，且很难实现对CTC的高效分析鉴定，同样容易对CTC的活性和功能造成伤害。
[0003]因此，有必要开发一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法，能够实现高效、高灵敏度地分离和捕获，且保留高生物活性。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本申请实施例提供了一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法和应用，该方法能够实现对微纳米生物活性物质高效、高灵敏度地分离和捕获，且保留高生物活性。该方法操作简单，成本低，适用于包括细胞、囊泡、核酸和蛋白质等小尺寸的生物活性物质的分离和捕获，尤其是对于单细胞。
[0005]第一方面，本申请提供了一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法，包括以下步骤：
[0006]提供待测样品，所述待测样品内含有微纳米生物活性物质；
[0007]用含DNA探针的第一缓冲溶液对所述待测样品进行预处理后，转移至含有第一茎环结构链的第二缓冲溶液中，得到第一溶液，所述DNA探针包括引发链和连接在所述引发链一端的靶向序列，所述靶向序列用于靶标所述微纳米生物活性物质；
[0008]使用微液滴生成装置，将所述第一溶液形成油包水微液滴，每个所述油包水微液滴形成过程中，均注入有等量含第二茎环结构链的第三缓冲溶液，收集所述油包水微液滴，经恒温培养后，靶标在所述微纳米生物活性物质上的引发链触发所述第一茎环结构链和所述第二茎环结构链杂交，以使所述含有所述微纳米生物活性物质的油包水微液滴固化形成水凝胶微胶囊；
[0009]将所述经恒温培养后的所述油包水微液滴进行过膜处理，收集所述水凝胶微胶囊，以实现对所述微纳米生物活性物质分离捕获。
[0010]本申请实施方式中，当引发链、第一茎环结构链和所述第二茎环结构链共存于一个体系之中时，所述引发链能够触发第一茎环结构链和所述第二茎环结构链杂交，自组装
形成稳定三维网状结构的DNA水凝胶。由于DNA探针中的引发链被靶标在待分离捕获的微纳米生物活性物质上，因此，只用包含有微纳米生物活性物质的油包水微液滴才能顺利固化形成水凝胶微胶囊。
[0011]本申请实施方式中，所述水凝胶微胶囊为一种DNA水凝胶，其为高度含水的三维网络状“软物质”，对于包裹在其中的微纳米生物活性物质可以起到很好的保护作用。所述水凝胶微胶囊的微观结构和性质类似于细胞外基质，当微纳米生物活性物质为细胞时，可以直接将其置于水凝胶微胶囊内进行培养，对细胞的生物活性影响可以忽略。本申请所述方法形成的水凝胶微胶囊可以很好地保持微纳米生物活性物质的高生物活性。
[0012]可选地，所述恒温培养的温度为0
‑
37℃，时间为3
‑
24小时。可选地，所述恒温培养的温度为25
‑
37℃，时间为3
‑
12小时。进一步地，可选地，所述恒温培养的温度为35
‑
37℃，时间为3
‑
5小时。例如，所述恒温培养的温度为37℃，时间为3小时。本申请实施方式中，所述恒温培养条件下，含有所述微纳米生物活性物质的油包水微液滴能够更快、更好地固化形成水凝胶微胶囊，减少对其生物活性的不利影响。
[0013]可选地，所述引发链包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；
[0014]所述第一茎环结构链包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，第二茎环结构链包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，或者所述第一茎环结构链包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，第二茎环结构链包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
[0015]本申请实施方式中，每个一所述微纳米生物活性物质粒子独立分布在一个所述油包水微液滴之中。通过调节微液滴生成装置的参数，从而可以调节油包水微液滴的尺寸大小，以使由所述微液滴生成装置生成的含有微纳米生物活性物质的油包水微液滴内仅单独分布一个所述微纳米生物活性物质粒子。例如，当所述微纳米生物活性物质为细胞时，所述水凝胶微胶囊内仅存在单细胞。
[0016]可选地，所述微纳米生物活性物质的横向尺寸小于或等于80μm。可选地，所述微纳米生物活性物质的横向尺寸小于或等于50μm。可选地，所述微纳米生物活性物质的横向尺寸小于或等于30μm。例如，所述微纳米生物活性物质的横向尺寸为1
‑
20μm。或者，所述微纳米生物活性物质的横向尺寸为1
‑
10μm。
[0017]本申请实施方式中，所述方法能够对小尺寸的微纳米生物活性物质进行分离和捕获，灵敏度高，分离纯度高。例如对CTC的分离捕获，由于CTC本质上仍然是尺寸仅有10微米左右的单个细胞，传统方法中很难高灵敏性、高纯度地分离获得CTC，分离的CTC中还混合有其他物质，如其他细胞或蛋白，本申请所述方法可以很好地解决这种小尺寸且含量低的微纳米生物活性物质的分离和捕获。
[0018]可选地，所述微纳米生物活性物质包括细胞、囊泡、核酸和蛋白质中的至少一种。
[0019]可选地，所述微纳米生物活性物质包括肿瘤细胞、囊泡、核酸和蛋白质中的至少一种。例如，所述微纳米生物活性物质包括肿瘤细胞、囊泡、核酸或蛋白质。或者，所述微纳米生物活性物质包括肿瘤细胞或囊泡。或者，所述微纳米生物活性物质为肿瘤细胞。所述肿瘤细胞可以但不限于为恶性肿瘤细胞。例如，所述肿瘤细胞选自人非小细胞肺癌细胞、人卵巢癌细胞、人肝癌细胞、人乳腺癌细胞、人喉癌细胞、人结直肠癌细胞和人黑色素瘤细胞中的至少一种。可选地，所述肿瘤细胞还可以为循环肿瘤细胞(CTC)。
[0020]可选地，所述微纳米生物活性物质为循环肿瘤细胞，所述DNA探针的所述靶向序列
包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。本申请实施方式中，包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的DNA探针能够特异性的识别CTC细胞，并固定在CTC细胞表面，以使含有CTC细胞的油包水微液滴内存在用于触发第一茎环结构链和所述第二茎环结构杂交形成DNA水凝胶的引发链，从而所述方法最后收集的每个水凝胶微胶囊内均含有单个CTC细胞。
[0021]可选地，所述DNA探针中，所述引发链与所述靶向序列直接连接，或所述引发链与所述靶向序列之间包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离捕获微纳米生物活性物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：提供待测样品，所述待测样品内含有微纳米生物活性物质；用含DNA探针的第一缓冲溶液对所述待测样品进行预处理后，转移至含有第一茎环结构链的第二缓冲溶液中，得到第一溶液，所述DNA探针包括引发链和连接在所述引发链一端的靶向序列，所述靶向序列用于靶标所述微纳米生物活性物质；使用微液滴生成装置，将所述第一溶液形成油包水微液滴，每个所述油包水微液滴形成过程中，均注入有等量含第二茎环结构链的第三缓冲溶液，收集所述油包水微液滴，经恒温培养后，靶标在所述微纳米生物活性物质上的引发链触发所述第一茎环结构链和所述第二茎环结构链杂交，以使所述含有所述微纳米生物活性物质的油包水微液滴固化形成水凝胶微胶囊；将所述经恒温培养后的所述油包水微液滴进行过膜处理，收集所述水凝胶微胶囊，以实现对所述微纳米生物活性物质分离捕获。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引发链包括如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；所述第一茎环结构链包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，第二茎环结构链包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，或者所述第一茎环结构链包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，第二茎环结构链包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微纳米生物活性物质包括细胞、囊泡、核酸和蛋白质中的至少一种。4.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述微纳米生物活性物质为循环肿瘤细胞，所述DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：玄曙光，冯鸿涛，陈艳，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：