检测人类冠状病毒感染力的方法技术

本案提供一种检测人类冠状病毒感染力的方法，包含下列步骤：(a)将一待测样本分为一第一样本及一第二样本；(b)以一嵌入染料或化学试剂处理该第一样本；(c)将该第一样本暴露于光下以进行光活化；(d)扩增该第一样本及该第二样本中的靶核酸；以及(e)根据该第一样本及该第二样本的扩增结果判定该人类冠状病毒的感染力。感染力。

【技术实现步骤摘要】
检测人类冠状病毒感染力的方法


[0001]本案关于一种人类冠状病毒的诊断，尤指一种检测人类冠状病毒感染力的方法。

技术介绍

[0002]用于检测活细胞的传统培养及显微镜检查方法是繁重、费力且费时的。另有一些能够通过染色技术来评估存活力的方法，例如BacLight荧光显微镜或吖啶橙(acridine orange)，抑或是结合染剂的流式细胞仪，以及无法检测特定病原体物种的细胞呼吸生理测试。这些基于培养的方法存在一些挑战，例如在众多背景微生物群中分离及鉴定特定病原体，以及低量病原体的检测，还有在繁琐的操作过程中可能给操作人员及环境带来潜在的生物安全性问题。此外，这些基于培养的方法还遇到另一个问题，即某些人类病原体可能会进入“可存活但不可培养的(viable but non
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culturable(VBNC)”的生理状态，在这种状态下，它们虽可存活但无法在自然宿主外生长。
[0003]靶向核酸的分子方法则彻底改变了微生物检测。基于DNA/RNA的方法，例如聚合酶链反应(polymerase chain reaction(PCR))或逆转录酶聚合酶链反应(reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT
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PCR)，是快速、通用、灵敏、精确的方法，且可特异性检测及/或定量食品、环境及临床样本中的微生物。尽管具有这些优点，分子方法仍面临一些挑战而无法广泛应用，其中，无法区分活细胞及非活细胞并导致微生物靶标的高估，被认为是基于核酸的检测方法的主要缺点。
[0004]称为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2(SARS
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CoV
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2))的新型冠状病毒于2019年12月出现，其可通过实时RT
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PCR(qRT
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PCR)以靶向其RNA基因组片段的引物来检测。qRT
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PCR具有高灵敏度、特异性，以及能够在临床样本中提供可靠的定量/定性数据，尽管检测结果并不表示检测到的病毒具有感染力。许多实验室选择通过PCR/RT
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PCR分析病毒基因组的存在，这仍是可接受的技术，只要了解其局限性，亦即它可以检测核酸，而不是感染性病毒。
[0005]Covid
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19患者可出院或结束隔离应满足的标准之一：至少2次连续的RT
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PCR阴性结果，且中间至少间隔24小时。然而在某些情况下，尽管已经没有其他所有临床症状，但由于RT
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PCR阳性结果的持续存在，Covid
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19患者仍无法出院。专家们对使用当前的RT
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PCR方法进行的复原后测试提出了疑问，令人担忧的是，这种检测方法被曲解，使得可能不具感染力的病人仍被视为有感染力，并阻止他们重返工作岗位。多项研究表明，从鼻腔深处粘液取样并寻找病毒DNA/RNA片段的PCR/RT
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PCR检测，会使得一些从疾病中复原的人仍然长期得到阳性检测结果。
[0006]因此，实有必要提供一种能够快速且准确区分存活及非存活的SARS
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CoV
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2的方法，这对于管理Covid
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19患者的医生来说，将是非常重要的支持信息，因为细胞培养系统及动物模型尚未被证明是可靠或实用的。

技术实现思路

[0007]本案之目的在于提供一种利用活力PCR(viability PCR)来检测SARS
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CoV
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2感染力的方法，以快速且准确区分存活及非存活的SARS
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CoV
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2。
[0008]本案之另一目的在于提供一种利用活力PCR来检测人类冠状病毒感染力的方法，以快速且准确区分存活及非存活的病毒。
[0009]本案之再一目的在于提供一种评估人类冠状病毒外膜(membrane or envelope)完整性的方法，以判定人类冠状病毒的感染力。
[0010]为达上述目的，本案之一较广义实施方案为提供一种检测人类冠状病毒感染力的方法，包含下列步骤：(a)将一待测样本分为一第一样本及一第二样本；(b)以一嵌入染料或化学试剂(intercalating dye or chemical)处理该第一样本；(c)将该第一样本暴露于光下以进行光活化；(d)扩增该第一样本及该第二样本中的靶核酸；以及(e)根据该第一样本及该第二样本的扩增结果判定该人类冠状病毒的感染力。
[0011]为达上述目的，本案之另一较广义实施方案为提供一种评估人类冠状病毒外膜完整性的方法，包含下列步骤：(a)将一待测样本分为一第一样本及一第二样本；(b)以一嵌入染料或化学试剂处理该第一样本；(c)将该第一样本暴露于光下以进行光活化；(d)扩增该第一样本及该第二样本中的靶核酸；以及(e)根据该第一样本及该第二样本的扩增结果判定该人类冠状病毒的外膜完整性。
【附图说明】
[0012]图1及图2显示用于病毒感染力检测的活力qPCR/qRT
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PCR的操作流程示意图。图3及图4显示利用活力qRT
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PCR检测HCoV
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229E感染力的实验数据。图5显示利用活力qRT
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PCR检测HCoV
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OC43感染力的实验数据。图6显示利用活力qRT
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PCR检测SARS
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CoV
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2感染力的实验数据。【实施方式】
[0013]体现本案特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本案能够在不同的态样上具有各种的变化，其皆不脱离本案的范围，且其中的说明及图式在本质上系当作说明之用，而非用以限制本案。
[0014]本专利技术开发一种用于鉴别临床样本中的感染性及灭活/死病毒的方法，从而为Covid
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19患者的管理及治疗提供临床诊断信息。此方法使用一种核酸嵌入染料或化学试剂，会选择性地进入细胞膜受损的细胞，而完整的细胞膜则对该分子提供了屏障。一旦进入(死)细胞，染料或化学试剂就会嵌入细胞的核酸中，且由于叠氮基团(azide group)的存在，染料或化学试剂在暴露于强可见光后会与核酸共价交联。光解作用将叠氮基团转化为高反应性的氮烯基(nitrene radical)，可与附近的任何有机分子发生反应。考虑到嵌入染料或化学试剂的空间接近性，可以假定其与核酸发生反应的可能性很高，且该修饰会强烈抑制核酸扩增。与核酸发生交联的同时，任何未结合的过量染料或化学试剂会与水分子发生反应，所得的羟胺(hydroxylamine)则不再具有反应性，从而阻止了染料或化学试剂与从完整细胞中提取出的核酸发生反应。因此，通过这种机制，染料或化学试剂可以优选地插入本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测一人类冠状病毒感染力的方法，包含下列步骤：(a)将一待测样本分为一第一样本及一第二样本；(b)以一嵌入染料或化学试剂处理该第一样本；(c)将该第一样本暴露于光下以进行光活化；(d)扩增该第一样本及该第二样本中的靶核酸；以及(e)根据该第一样本及该第二样本的扩增结果判定该人类冠状病毒的感染力。2.如权利要求1所述的方法，其中该第二样本不进行染料处理及光活化。3.如权利要求1所述的方法，其中该第二样本经染料处理但不进行光活化。4.如权利要求1所述的方法，其中该第二样本不经染料处理但进行光活化。5.如权利要求1所述的方法，其中该嵌入染料或化学试剂为单叠氮化丙锭(propidium monoazide，PMA)染料、PMAxx染料、单叠氮化乙锭(ethidium monoazide，EMA)、铂化合物、钯化合物或试剂D。6.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中的染料处理时间为5至15分钟。7.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中的光活化时间为2至30分钟。8.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中，该第一样本暴露于一可见光下以进行光活化。9.如权利要求1所述的方法，其中该光的波长为450至480nm。10.如权利要求1所述的方法，其中该光的强度为85至250mW。11.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中的光活化期间的温度控制低于37℃。12.如权利要求1所述的方法，其中该第一样本及该第二样本用一缓冲系统提取，再接着进行核酸纯化及扩增。13.如权利要求1所述的方法，其中该第一样本及该第二样本与结合核酸提取及扩增步骤的缓冲系统直接混合。14.如权利要求1所述的方法，其中该核酸藉由PCR、RT
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PCR、或等温扩增方法进行扩增。15.如权利要求1所述的方法，其中该扩增的核酸藉由实时检测或终点检测进行检测。16.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(e)中用于感染力判定的一计算公式是基于该第一样本与该第二样本之间的Cq差值(ΔCq)。17.如权利要求1所述的方法，其中该靶核酸为RNA，且该靶核酸是用一对或多对引物将其逆转录并扩增。18.如权利要求1所述的方法，其中该靶核酸是用一或多个探针来检测。19.如权利要求1所述的方法，其中该人类冠状病毒为HCoV
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229E、HCoV
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NL63、HCoV
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OC43、HCoV
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HKU1、MERS
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【专利技术属性】
技术研发人员：张勇，倪嘉慧，张微石，龙全科，李娇娇，赵小智，蔡昆男，
申请(专利权)人：台达电子国际新加坡私人有限公司，
类型：发明
国别省市：