适用于治疗的脂质体RNA制剂的制备和储存制造技术

本公开内容涉及适用于治疗的脂质体RNA制剂的制备和储存，具体的涉及制备用于在肠胃外施用之后(特别是静脉内施用之后)将RNA递送至靶组织的RNA lipoplex颗粒的方法，以及包含这样的RNA lipoplex颗粒的组合物。本公开内容还涉及允许以符合工业GMP的方式制备RNA lipoplex颗粒的方法。此外，本公开内容涉及用于储存RNA lipoplex颗粒而基本上不损失产品品质(特别是基本上不损失RNA活性)的方法和组合物。合物。合物。

【技术实现步骤摘要】
适用于治疗的脂质体RNA制剂的制备和储存
[0001]本申请是申请号为201880068224.2的专利技术名称为“适用于治疗的脂质体RNA制剂的制备和储存”的中国专利申请的分案申请，原申请是2018年10月18日提交的PCT国际申请PCT/EP2018/078587于2020年04月20日进入中国国家阶段的申请。


[0002]本公开内容涉及制备用于肠胃外施用之后(特别是静脉内施用之后)将RNA递送至靶组织的RNA lipoplex颗粒的方法，以及包含这样的RNA lipoplex颗粒的组合物。本公开内容还涉及允许以符合工业GMP的方式制备RNA lipoplex颗粒的方法。此外，本公开内容涉及用于储存RNA lipoplex颗粒而基本上不损失产品品质(特别是基本上不损失RNA活性)的方法和组合物。本文中所述的RNA lipoplex颗粒制剂可通过冷冻干燥、喷雾干燥或相关方法冷冻或脱水，使得能够获得与液体储存相比延长的产品货架期(shelf
‑
life)。在一个实施方案中，RNA lipoplex颗粒包含单链RNA，例如编码目的肽或蛋白质(例如药物活性肽或蛋白质)的mRNA。RNA被靶组织的细胞吸收，并且RNA被翻译成可表现出其生理活性的编码的肽或蛋白质。目的肽或蛋白质可以是包含一个或更多个表位的肽或蛋白质，以用于诱导或增强针对所述一个或更多个表位的免疫应答。本文中所述的方法和组合物适合于以符合药物产品的要求，更具体地，符合GMP制造的要求和用于肠胃外施加的药物产品的品质的要求的方式使用。

技术介绍

[0003]使用RNA将外来遗传信息递送到靶细胞中提供了DNA的有吸引力的替代方案。使用RNA的优点包括瞬时表达和非转化特征。RNA不需要进入细胞核以进行表达，并且此外，RNA不会整合到宿主基因组中，从而消除肿瘤发生的风险。
[0004]RNA可通过所谓的lipoplex制剂递送，其中RNA与由阳离子脂质与辅助脂质(helper lipid)的混合物构成的脂质体结合以形成可注射的纳米颗粒制剂。然而，即使在制剂的储存之后，用于将生物活性RNA递送至靶组织的制剂的开发是未满足的需求。另外，用于符合GMP来制备可注射RNA lipoplex颗粒制剂的提供长货架期的方法的开发仍是未满足的需求。
[0005]因此，需要提供用于将生物活性RNA递送至靶组织的制剂，其中所递送的RNA被有效地翻译成其编码的肽或蛋白质。此外，需要提供这样的制剂，其是货架稳定的基本上不损失产品品质，并且特别是基本上不损失RNA的生物学活性。
[0006]本专利技术人出人意料地发现，本文中所述的RNA lipoplex颗粒制剂满足上述要求。

技术实现思路

[0007]I.用于制备RNA lipoplex颗粒的方法、RNA lipoplex颗粒和包含RNA lipoplex颗粒的组合物
[0008]在第一方面，本公开内容涉及用于制备具有改善的生物学活性的RNA lipoplex颗
粒的方法、根据本公开内容制备的RNA lipoplex颗粒以及包含这样的RNA lipoplex颗粒的组合物。RNA lipoplex颗粒和包含RNA lipoplex颗粒的组合物可用于肠胃外施用之后，特别是静脉内施用之后将RNA递送至靶组织。RNA lipoplex颗粒使用通过将在乙醇中的高度浓缩的脂质溶液注入到水或合适的水相中而获得的脂质体来制备。在一个实施方案中，RNA lipoplex产物的特征在于x射线散射中的特定模式，其中观察到在约1nm
‑1处的单个布拉格峰(Bragg peak)，其中峰宽小于0.2nm
‑1。
[0009]在一个实施方案中，脂质体和RNA lipoplex颗粒包含1,2
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二
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O
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十八碳烯基
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三甲基铵丙烷(DOTMA)和1,2
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十八烯酰基)
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甘油基
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磷酸乙醇胺(DOPE)。脂质混合物中DOPE的浓度高于单独的乙醇中DOPE的平衡溶解度。在室温下，DOPE单独具有约50mM的溶解度，与DOTMA一起其则具有100mM或更高的溶解度。形成从中获得高活性lipoplex的脂质体的脂质溶液可具有270mM或更高的总脂质浓度(例如，90mM或更高的DOPE)。通过提高温度可获得乙醇中甚至更高浓度的溶液。从其中DOPE的浓度高于平衡溶解度的脂质溶液获得的脂质体显著大于来自其中DOPE的浓度处于平衡溶解度和以下的脂质溶液的脂质体。脂质体尺寸随在乙醇中的浓度而单调提高。
[0010]根据本公开内容制备的脂质体可通过将该脂质体与RNA混合而用于制备RNA lipoplex颗粒。在一个实施方案中，在混合之前将RNA与NaCl一起孵育以调整lipoplex的活性提高所需的特定离子强度。由这些较大的脂质体形成的lipoplex具有显著更高的生物学活性，如通过体外和体内实验所证明的。可通过某些物理化学参数将这些具有较高活性的lipoplex与具有较低活性的那些清楚地区分开，所述物理化学参数例如(i)较低的布拉格峰峰宽，以及(ii)在用于尺寸测量的分散分析方法，如场
‑
流分级(field
‑
flow fractionation)中的不同分离谱。具有较低活性的lipoplex平均更小。另外，它们还具有不同的洗脱曲线，这可能与如分子构象、形状以及与本体相(bulk phase)的相互作用等参数相关。
[0011]因此，在这个方面，本公开内容涉及产生脂质体胶体的方法，其包括将在乙醇中的脂质溶液注入到水相中以产生脂质体胶体，其中所述脂质溶液中至少一种脂质的浓度对应于或高于所述至少一种脂质在乙醇中的平衡溶解度。
[0012]在一个实施方案中，所述方法包括将脂质溶液加热以提高脂质溶液中脂质的浓度。在一个实施方案中，将脂质溶液加热至至少约40℃或至少约60℃的温度。
[0013]在一个实施方案中，脂质溶液是两种或更多种不同脂质的混合物的溶液。
[0014]在一个实施方案中，脂质溶液中一种脂质的浓度对应于或高于脂质在乙醇中的平衡溶解度。
[0015]在一个实施方案中，脂质溶液中的总脂质浓度为约180mM至约600mM、约300mM至约600mM、或约330mM。
[0016]在一个实施方案中，脂质溶液包含至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质。
[0017]在一个实施方案中，脂质溶液中的另外的脂质的浓度对应于或高于所述另外的脂质在乙醇中的平衡溶解度。
[0018]在一个实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1,2
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二
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O
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十八碳烯基
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三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1,2
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二油酰基
‑3‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.产生脂质体胶体的方法，其包括将在乙醇中的脂质溶液注入到水相中以产生所述脂质体胶体，其中所述脂质溶液中至少一种脂质的浓度对应于或高于所述至少一种脂质在乙醇中的平衡溶解度。2.权利要求1所述的方法，其中所述脂质溶液是两种或更多种不同脂质的混合物的溶液。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述脂质溶液中一种脂质的浓度对应于或高于室温下所述脂质在乙醇中的平衡溶解度。4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液中的总脂质浓度为约180mM至约600mM、约300mM至约600mM、或约330mM。5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液包含至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质。6.权利要求5所述的方法，其中所述脂质溶液中的另外的脂质的浓度对应于或高于所述另外的脂质在乙醇中的平衡溶解度。7.权利要求5或6所述的方法，其中所述至少一种阳离子脂质包含1,2
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二
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O
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十八碳烯基
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三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1,2
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二油酰基
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三甲基铵丙烷(DOTAP)。8.权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述至少一种另外的脂质包含1,2
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二
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十八烯酰基)
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甘油基
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磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)和/或1,2
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二油酰基
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sn
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甘油基
‑3‑
磷酸胆碱(DOPC)。9.权利要求5至8中任一项所述的方法，其中所述至少一种阳离子脂质包含1,2
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二
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O
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十八碳烯基
‑3‑
三甲基铵丙烷(DOTMA)，并且所述至少一种另外的脂质包含1,2
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十八烯酰基)
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甘油基
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磷酸乙醇胺(DOPE)。10.权利要求5至9中任一项所述的方法，其中所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约10:0至约1:9、约4:1至约1:2、约3:1到约1:1、或约2:1。11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液包含摩尔比为约10:0至约1:9、约4:1至约1:2、约3:1至约1:1、或约2:1的DOTMA和DOPE。12.权利要求8至11中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液中DOPE的浓度为至少约60mM或至少约90mM。13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中将所述脂质溶液注入到约50rpm至约150rpm的水相搅拌速度的所述水相中。14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述水相是水。15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述方法还包括搅拌所述脂质体胶体。16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中将所述脂质体胶体搅拌约15分钟至约60分钟，或搅拌约30分钟。17.产生脂质体胶体的方法，其包括将在乙醇中包含摩尔比为约2:1的DOTMA和DOPE的脂质溶液注入到以约150rpm的搅拌速度搅拌的水中以产生所述脂质体胶体，其中在所述脂质溶液中DOTMA和DOPE的浓度为约330mM。18.脂质体胶体，其能够通过权利要求1至17中任一项所述的方法获得。19.权利要求18所述的脂质体胶体，其中所述脂质体的平均直径为至少约250nm。20.权利要求18或19所述的脂质体胶体，其中所述脂质体的平均直径为约250nm至约
800nm。21.权利要求18至20中任一项所述的脂质体胶体，其中所述脂质体是阳离子脂质体。22.权利要求18至21中任一项所述的脂质体胶体，其中所述脂质体包含至少一种阳离子脂质和至少一种另外的脂质。23.权利要求22所述的脂质体胶体，其中所述至少一种阳离子脂质包含1,2
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十八碳烯基
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三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1,2
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二油酰基
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三甲基铵丙烷(DOTAP)。24.权利要求22或23所述的脂质体胶体，其中所述至少一种另外的脂质包含1,2
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十八烯酰基)
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磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Chol)和/或1,2
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二油酰基
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磷酸胆碱(DOPC)。25.权利要求22至24中任一项所述的脂质体胶体，其中所述至少一种阳离子脂质包含1,2
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二
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十八碳烯基
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三甲基铵丙烷(DOTMA)，并且所述至少一种另外的脂质包含1,2
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二
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十八烯酰基)
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磷酸乙醇胺(DOPE)。26.权利要求22至25中任一项所述的脂质体胶体，其中所述至少一种阳离子脂质与所述至少一种另外的脂质的摩尔比为约10:0至约1:9、约4:1至约1:2、约3:1至约1:1、或约2:1。27.权利要求18至26中任一项所述的脂质体胶体，其中所述脂质体包含摩尔比为约10:0至约1:9、约4:1至约1:2、约3:1至约1:1、或约2:1的DOTMA和DOPE。28.制备RNA lipoplex颗粒的方法，其包括将权利要求18至27中任一项所述的脂质体胶体添加至包含RNA的溶液。29.用于连续流制备RNA lipoplex颗粒的方法，其包括在RNA和阳离子脂质体的受控混合条件下将包含RNA的溶液与包含阳离子脂质体的溶液混合。30.权利要求29所述的方法，其中所述包含阳离子脂质体的溶液是权利要求18至27中任一项所述的脂质体胶体。31.权利要求29或30所述的方法，其中所述包含RNA的溶液和所述包含阳离子脂质体的溶液是水性溶液。32.权利要求29至31中任一项所述的方法，其中使用允许所述包含RNA的溶液与所述包含阳离子脂质体的溶液混合的流速。33.权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述流的特征在于雷诺数大于300，或约500至约2100。34.权利要求29至33中任一项所述的方法，其中所述受控混合条件包括控制所述包含RNA的溶液与所述包含阳离子脂质体的溶液的混合比。35.权利要求29至34中任一项所述的方法，其中所述受控混合条件包括控制待混合的所述包含RNA的溶液与所述包含阳离子脂质体的溶液的相对体积。36.权利要求29至35中任一项所述的方法，其中通过使用相同混合体积(v/v)的所述包含RNA的溶液和所述包含阳离子脂质体的溶液以及调整相应溶液中RNA和阳离子脂质体的浓度来控制所述RNA与所述阳离子脂质体的混合比。37.权利要求29至36中任一项所述的方法，其中选择所述受控混合条件以在避免堵塞的同时维持所述RNA lipoplex颗粒的特征。38.权利要求29至37中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用Y型或T型混合元件。
39.权利要求29至38中任一项所述的方法，其中所述Y型或T型混合元件的直径为约1.2mm至约50mm。40.权利要求29至39中任一项所述的方法，其中所述方法包括使用注射泵，其中将两个注射器平行地插入到同一泵中，所述两个注射器的一个包含所述包含阳离子脂质体的溶液并且一个包含所述包含RNA的溶液。41.权利要求29至40中任一项所述的方法，其中所述方法包括将压力容器、膜泵、齿轮泵、磁悬浮泵或蠕动泵与流速传感器组合使用，所述流速传感器任选地具有用于在线控制和实时调整流速的反馈回路。42.权利要求29至41中任一项所述的方法，其中所述包含RNA的溶液与所述包含脂质体的溶液的混合物包含浓度为约45mM至约300mM的氯化钠，或包含对应于浓度为约45mM至约300mM的氯化钠的离子强度。43.权利要求29至42中任一项所述的方法，其中所述包含RNA的溶液与所述包含脂质体的溶液的混合物具有至少约50mM的离子强度。44.权利要求28至43中任一项所述的方法，其中在X射线散射模式中，所述RNA lipoplex的特征在于在约1nm
‑1处的单个布拉格峰，其中所述峰宽小于0.2nm
‑1。45.权利要求28至44中任一项所述的方法，其中所述RNA lipoplex颗粒的平均直径为约200至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm、或约350nm至约400nm。46.制备包含RNA lipoplex颗粒的冷冻组合物的方法，其包括(i)提供包含RNA lipoplex颗粒和稳定剂的水性组合物，以及(ii)冷冻所述组合物。47.权利要求46所述的方法，其中冷冻在约
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15℃至约
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40℃、或在约
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30℃的温度下进行。48.权利要求47所述的方法，其中所述稳定剂是选自单糖、二糖、三糖、糖醇、寡糖或其相应糖醇、和直链多元醇的碳水化合物。49.权利要求46至48中任一项所述的方法，其中提供包含RNA lipoplex颗粒和稳定剂的水性组合物包括提供包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物并向所述包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物添加所述稳定剂。50.权利要求46至49中任一项所述的方法，其中向所述包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物添加所述稳定剂降低所述包含RNA lipoplex颗粒的水性组合物的离子强度。51.权利要求46至50中任一项所述的方法，其中在所述包含RNA lipoplex颗粒和稳定剂的水性组合物中稳定剂的浓度高于生理渗量浓度所需的值。52.权利要求46至51中任一项所述的方法，其中在所述包含RNA lipoplex和稳定剂的水性组合物中稳定剂的浓度足以维持所述RNA lipoplex颗粒的品质，并且特别地避免在将所述组合物在约
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15℃至约
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40℃的温度下储存至少一个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月、或至少36个月之后RNA活性的实质性损失。53.权利要求46至52中任一项所述的方法，其中所述包含RNA lipoplex和稳定剂的水性组合物中的pH低于通常对于RNA储存而言最佳的pH。54.权利要求46至53中...

【专利技术属性】
技术研发人员：海因里希，
申请(专利权)人：生物技术公司，
类型：发明
国别省市：