一种智能光控CRISPR纳米载体及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种智能光控CRISPR纳米载体，包括阳离子聚合物/相变材料核壳结构和CRISPR基因编辑系统，所述CRISPR基因编辑系统附着于阳离子聚合物/相变材料核壳结构中，所述智能光控CRISPR纳米载体的粒径为30～200nm；所述阳离子聚合物/相变材料核壳结构包括光热剂、相变材料、阳离子聚合物。该智能光控CRISPR纳米载体具有良好的生物相容性和细胞转染效率，解决现有技术中CRISPR基因编辑系统在细胞内的递送和释放难以精确控制的问题。本发明专利技术还提供了一种智能光控CRISPR纳米载体的制备方法。制备方法。制备方法。

【技术实现步骤摘要】
一种智能光控CRISPR纳米载体及其制备方法


[0001]本专利技术涉及纳米生物医药
，具体涉及一种智能光控CRISPR纳米载体及其制备方法。

技术介绍

[0002]CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)基因编辑系统是最近发现的一种新型的基因定点编辑技术，由规律成簇的短间隔重复(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR associated protein,Cas)两部分构成，能够通过使用序列特异性导向RNA分子(sequence
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specific guide RNA,gRNA)引导核酸内切酶到靶点，完成对目标基因的删除、添加、激活或抑制。作为近年来最热门的基因编辑工具，CRISPR在癌症、脑部神经疾病、遗传病等重大疾病的治疗、检测等领域显示出巨大的应用前景。
[0003]目前，研究人员主要使用慢病毒、腺病毒及腺相关病毒等病毒型载体递送CRISPR基因编辑系统，其免疫原性较大，可能会引起不希望的自身免疫反应和致癌作用。而且，病毒载体还可能引起插入突变的现象，导致基因编辑存在极大的安全隐患。此外，病毒载体携带DNA的能力有限，且装载质粒过程繁琐，在实际使用过程中难以普及和推广。从2014年开始，非病毒CRISPR载体在基因治疗领域的研究获得了广泛的关注，如专利CN 107557393 A公开了一种由磁性纳米材料介导的CRISPR/Cas9 T细胞内递送系统制备方法，将CRISPR系统与阳离子聚合物修饰的磁性纳米颗粒复合，最终在磁场介导下将CRISPR系统介导到T细胞内。专利号CN 104306987B公开了另一种基因载体，其以金纳米颗粒为骨架，利用修饰过的牛血清蛋白包裹金纳米颗粒，原子转移自由基聚合法(ATRP)合成以多糖为骨架的聚阳离子，获得了高于“金标”聚乙烯亚胺(PEI)的转染效率和较低毒性的基因载体，且该载体具有良好的CT成像效果。非病毒脂质体和阳离子聚合物载体虽然具有成本低、制备简单、便于大规模生产、安全性高、有效荷载量大等优点，但是其不足之处也较为明显：(1)易被网状内皮系统(RES)清除而影响被靶细胞的内在化，结果造成细胞转染效率不足；(2)在细胞内降解快，导致基因药物不能在胞内高效富集，外源基因转导到宿主细胞后表达时间短；(3)载体被细胞内化后只能被动释放，导致基因编辑难以快速激活，限制了基因编辑的效率。因此，探索具有高转染效率、高稳定性和能够精确释放的适合临床精准治疗的新型CRISPR智能载体成为生物医药领域亟待解决的关键科学问题。
[0004]最近，具有智能响应性的CRISPR纳米载体获得了研究者的极大关注。智能响应性载体通过外部或内部刺激，对CRISPR系统的释放进行按需控制，实现CRISPR的精准释放和治疗。2016年，塔夫茨大学和哈佛大学的研究者制备了含有二硫键的还原响应性阳离子脂质体，用其负载Cas9/sgRNA复合物[1]。当脂质体进入到细胞并成功内涵体逃逸后，细胞质中的还原性物质促使二硫键断裂，从而快速释放负载的Cas9和sgRNA，最终实现超70％的基因编辑效率。2019年，来自中国科学院的王明课题组报道了三磷酸腺苷(ATP)响应性沸石咪唑骨架
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90(ZIF
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90)递送CRISPR系统[2]。该系统通过2
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醛基咪唑、Zn2+以及CRISPR/Cas9的自组装形成。当ATP存在时，ATP可与ZIF
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90递送系统中的Zn2+之间竞争性配位，使递送体系
降解并释放Cas9蛋白质，最终实现高达35％的绿色荧光蛋白敲除效率。南开大学的史林启课题组构建了肿瘤微环境响应的多级递送高分子CRISPR载体，利用2,3
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二甲基马来酸酐修饰的聚乙二醇
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b
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聚赖氨酸(PEG
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b
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PLys)覆盖苯硼酸修饰的枝化PEI和CRISPR/Cas9质粒复合物。在肿瘤微酸性环境中，由于PLys发生电荷翻转而导致PEG
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b
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PLys从PEI/质粒复合物表面脱离，进而释放CRISPR
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Cas9[3]。南京大学宋玉君课题组将光响应的分子连接上转换载体粒子(UCNPs)和CRISPR
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Cas9系统，在近红外光照射下，UCNPs发射出的紫外光能够打开该连接的小分子，释放Cas9蛋白，实现了精准基因编辑[4]。近日，来自新南威尔士大学的科学家们开发了一种装载有维替泊芬(一种光触发剂)的脂质体递送系统，该系统具有较高的体外转染效率，用LED光束照射能够释放有效载荷，通过体内eGFP报告系统在单细胞分辨率下的慢肌纤维敲出率达到77％[5]。以上研究目前未有相关公开专利。
[0005]由此可见，现有的智能CRISPR载体技术方案的研究目前在国内外还处于起步阶段，构建更多创新实用的智能CRISPR载体方案仍是解决CRISPR基因编辑技术的临床应用难题、促进个体化医疗发展的重点研究方向。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种智能光控CRISPR纳米载体及其制备方法，以解决现有CRISPR系统进入细胞后基因编辑在时间和空间上不可控的缺陷,为CRISPR系统的精准递送提供更多技术方案。
[0007]第一方面，本专利技术提供了一种智能光控CRISPR纳米载体，包括阳离子聚合物/相变材料核壳结构和CRISPR基因编辑系统，所述CRISPR基因编辑系统附着于阳离子聚合物/相变材料核壳结构中，所述智能光控CRISPR纳米载体的粒径为30～200nm；
[0008]所述阳离子聚合物/相变材料核壳结构包括光热剂、相变材料、阳离子聚合物。
[0009]本专利技术提供一种以阳离子聚合物/相变材料(Phase Change Materials,PCM)核壳结构为载体的智能光响应CRISPR纳米载体，该载体能够介导CRISPR基因编辑工具被细胞摄取，并通过体外光照来远程精确控制CRISPR基因编辑工具的释放，最终解决基因编辑系统在细胞内的递送和释放不可控的问题。该方法原料价格低廉，制备过程温和，自组装过程简单易行，制备得到产物具有良好的生物相容性和细胞转染效率，为远程操控基因编辑技术提供了方法，为实现临床个性化精准医疗提供了思路。
[0010]本专利技术智能光控CRISPR纳米载体包括阳离子聚合物/相变材料核壳结构和CRISPR基因编辑系统，借助于CRISPR基因编辑系统实现基因编辑功能。智能光控CRISPR纳米载体携带CRISPR基因编辑系统并递送到细胞内进行可控释放，具体可控释放的原理为：阳离子聚合物/相变材料核壳结构具有优异生物光热转换性能以及温度相变功能。当需要释放时，采用辐照阳离子聚合物/相变材料核壳结构时，阳离子聚合物/相变材料核壳结构吸收光照并进行光热转换，阳离子聚合物/相变材料核壳结构升温并进一步发生相变以释放CRISPR本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种智能光控CRISPR纳米载体，其特征在于，包括阳离子聚合物/相变材料核壳结构和CRISPR基因编辑系统，所述CRISPR基因编辑系统附着于阳离子聚合物/相变材料核壳结构中，所述智能光控CRISPR纳米载体的粒径为30～200nm；所述阳离子聚合物/相变材料核壳结构包括光热剂、相变材料、阳离子聚合物。2.如权利要求1所述的智能光控CRISPR纳米载体，其特征在于，所述阳离子聚合物/相变材料核壳结构与CRISPR基因编辑系统的用量比为1～30:1。3.如权利要求1所述的智能光控CRISPR纳米载体，其特征在于，所述光热剂为吲哚菁绿、碘化物、石墨烯量子点、黑磷量子点、硒量子点、金纳米颗粒及其复合物中的至少一种。4.如权利要求1所述的智能光控CRISPR纳米载体，其特征在于，所述相变材料为有机脂肪酸，包括天然脂肪酸或者人工合成脂肪酸。5.如权利要求1所述的智能光控CRISPR纳米载体，其特征在于，所述阳离子聚合物为聚丙烯氯化铵、L
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多聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、D
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多聚赖氨酸、阳离子聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、壳聚糖和脂质体中的至少一种。6.如权利要求1所述的智能光控CRISPR纳米载体，其特征在于，所述CRISPR基因编辑系统为CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas13a、CRISPR/Cas12a中的至少一种。7.一种智能光控CRISPR纳米载体的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢中建，张晗，柴路晓，陈挚，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：