一种促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵培养基及发酵工艺制造技术

本发明专利技术提供了一种促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵培养基及发酵工艺。所述的HER2亲和体蛋白为带有pel信号肽的HER2亲和体重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。所述的促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵培养基，包括基础料和补料，所述的基础料配方如下：蛋白胨8

【技术实现步骤摘要】
一种促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵培养基及发酵工艺


[0001]本专利技术属于重组蛋白表达领域，具体地说，涉及一种促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵培养基及发酵工艺。

技术介绍

[0002]大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统是目前应用最广泛、研究最透彻的表达系统之一，具有发酵周期短、生产效率高，操作简便等显著优势。当前大肠杆菌目标蛋白表达一般为胞内表达，目前报道目标蛋白分泌表达到发酵培养基的情况非常之少。因为大肠杆菌分泌系统的组成元件复杂，调控精细以及固有的双层膜结构，所以大肠杆菌表达系统的分泌性能很差。
[0003]目标蛋白分泌表达到发酵上清液中，或称胞外表达，不仅有助于蛋白折叠，产生天然活性蛋白，还有利于降低包涵体的形成量。同时，使用发酵上清液进行下游纯化生产，无需进行菌体破碎及二次离心，省去价格高昂的均质机设备，以及一次性进口深层过滤设备等，即可简化工艺步骤、降低生产成本。此外，发酵上清液中目标蛋白可占70％及以上，杂蛋白非常少，极有利于下游纯化，减少杂蛋白对产品的污染。还有，在生物医药行业蛋白药物领域，涉及内毒素、宿主蛋白残留、宿主DNA残留等问题，内毒素可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及播散性血管内凝血等，涉及细胞和动物实验时，一般对内毒素控制都有严格要求；大肠杆菌破碎或者裂解后产生大量内毒素，100万
‑
1000万EU/mL级别，根据相关法规，需要降至约10EU/mL以内，导致后续纯化去除内毒素压力非常大；而使用发酵上清液进行生产，其不涉及菌体裂解与破碎，内毒素含量很低，极有利于后续工艺内毒素的去除，以及有效避免菌体宿主胞内背景蛋白对蛋白纯化的影响，利于提高产品内毒素、宿主蛋白残留、宿主DNA残留等相关指标。因此，大肠杆菌重组蛋白的分泌表达，特别在医药行业具有十分重要的意义。
[0004]大肠杆菌的分泌型蛋白,它们在N端或C端带有一定的结构(包含着分泌信号)，其中N端带有信号肽分子的蛋白。目前采用的信号肽一般来自大肠杆菌的外膜蛋白(如外膜蛋白A OmpA、OmpF、λ噬菌体受体LamB、热稳定肠毒素ST等)或周质蛋白(如碱性磷酸酶PhoA、麦芽糖结合蛋白MBP、DsbA等),此外金黄色葡萄球菌蛋白A和胡萝卜软腐欧文氏果胶酶裂解酶(PelB)的信号肽也常被采用。
[0005]人表皮生长因子受体2(HER2)亲和体分子，因其具有对靶组织亲和力高、特异性强、分子量小、制备简单、生物动力学特征良好等特点，近年来在肿瘤分子影像方面的研究中显示出了较好的临床应用前景。放射性核素标记HER2亲和体分子探针不仅可以进行肿瘤受体显像及疗效评价，特别是乳腺癌阳性患者的显像，还可以用于靶向治疗。
[0006]现有技术中，有研究尝试在构建大肠杆菌载体时，添加信号肽，以期实现分泌表达；然而即使载体添加信号肽，很多目标蛋白也不一定能够实现分泌表达；特定蛋白选择适宜的信号肽才能一定程度上实现分泌表达；但是大部分情况下，仅有40
‑
50％目标蛋白分泌表达于发酵培养基中，仍有50
‑
60％目标蛋白表达于发酵菌体里；反而造成下游处理工艺的
复杂性。
[0007]如果能够实现目标蛋白分泌表达，且加之十分有效的发酵培养基配方与诱导表达工艺，实现绝大部分目标蛋白分泌表达，以上缺陷或都可以弥补。
[0008]过去的几十年里已经见证了跨膜转运机制和蛋白分泌机制研究的显著进展，信号肽的提出不仅为蛋白质的研究开辟了新的领域一蛋白质的空间属性，更为基因工程与蛋白质工程技术的应用提供了有效手段；目前，大肠杆菌的分泌表达系统已在基因工程
得到了广泛的应用，然而相当多的重组蛋白的大规模表达还存在众多的技术瓶颈，最主要就是分泌表达量低。见何冰芳等人发表的“大肠杆菌蛋白质分泌机理及其重组蛋白分泌表达新进展”。
[0009]近几年来不同物种的重组蛋白已在大肠杆菌中成功分泌表达，但表达水平基本维持在10mg/L，限制了其大规模生产商业化的应用。见王靖瑶等人发表的“大肠杆菌I型分泌表达系统研究进展及提高蛋白表达量的策略”。
[0010]目前未有HER2亲和体蛋白利用大肠杆菌分泌，或渗透，或胞外表达的相关专利与文献。

技术实现思路

[0011]为了克服现有技术的不足，本专利技术的第一个目的是提供一种促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵培养基，本专利技术的第二个目的是提供一种促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵工艺。
[0012]本专利技术中，因改造优化后HER2亲和体蛋白分子量仅7.7kd，分子量较小，一定程度上更有利于蛋白分泌表达；通过基因工程手段，将pel信号肽基因与HER2目标蛋白基因整合到大肠杆菌中进行发酵表达，通过多种发酵配方与工艺对比，筛选出可实现80
‑
90％目标蛋白表达于发酵上清液的发酵配方与工艺。
[0013]大肠杆菌体系蛋白表达，具有发酵周期短、生产效率高，操作简便的优点，如果做到分泌表达到发酵上清液中，不仅有利于降低包涵体的形成，有助于产生天然活性蛋白；同时，使用发酵上清液进行下游纯化生产，无需进行菌体破碎及二次离心，省去价格高昂的均质机设备，以及一次性进口深层过滤设备等，即可简化工艺步骤、降低生产成本。此外，发酵上清液中目标蛋白占比很高，杂蛋白非常少，极有利于下游纯化。还有，在生物医药行业蛋白药物领域，极有利于后续工艺内毒素的去除，利于提高产品指标。
[0014]为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
[0015]本专利技术提供的第一个目的是提供促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵培养基，
[0016]所述的HER2亲和体蛋白为带有pel信号肽的HER2亲和体重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述的带有pel信号肽的HER2亲和体重组蛋白由基因工程菌分泌表达，所述的基因工程菌转化有重组质粒表达载体，所述重组质粒表达载体中含有如下基因：1)核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的编码pel信号肽的基因；2)核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的编码未带有pel信号肽的HER2亲和体蛋白的基因；
[0017]本专利技术中，带有pel信号肽的HER2亲和体重组蛋白表达的基因工程菌为基因工程大肠杆菌菌株，宿主菌为BL21(DE)3，质粒为pET22b(+)。
[0018]所述的发酵培养基包括基础料和补料；
[0019]所述的基础料配方如下：蛋白胨8
‑
15g/L,酵母浸出粉5
‑
8g/L，甘油5
‑
10g/L，无水硫酸钠0.7
‑
2g/L，无水硫酸镁0.7
‑
2g/L，无水磷酸二氢钾4
‑
6g/L，无水磷酸氢二钾8
‑
10g/L，消泡剂0.3
‑
0.5g/L。基础料配制方法：将上述组分用水充分溶解，pH为6.5
‑
7.5，1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵培养基，其特征在于；所述的HER2亲和体蛋白为带有pel信号肽的HER2亲和体重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.6所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示； 所述的带有pel信号肽的HER2亲和体重组蛋白由基因工程菌分泌表达，所述的基因工程菌转化有重组质粒表达载体，所述重组质粒表达载体中含有如下基因：1）核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的编码pel信号肽的基因；2）核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的编码未带有pel信号肽的HER2亲和体蛋白的基因；所述的发酵培养基包括独立的基础料和补料：所述的基础料配方如下：蛋白胨8
‑
15g/L,酵母浸出粉5
‑
8g/L，甘油5
‑
10g/L，无水硫酸钠0.7
‑
2g/L，无水硫酸镁0.7
‑
2g/L，无水磷酸二氢钾4
‑
6g/L，无水磷酸氢二钾8
‑
10g/L，消泡剂0.3
‑
0.5g/L；所述的补料配方如下：蛋白胨40
‑
60g/L，酵母浸出粉20
‑
30g/L，甘油300
‑
400g/L，另配置10
‑
15%浓度氨水。2.采用如权利要求1所述的发酵培养基促进HER2亲和体蛋白分泌表达的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：1）平板培养：将配置有固体培养基的摇瓶灭菌后，冷却凝固前50℃加入终浓度50
‑
100ppm卡那霉素混合均匀，按照10
‑
15mL/皿倒平板；待平板凝固后，取HER2甘油管菌株，四分区划线涂布于卡那抗性平板上，过夜培养12
‑
16h，以备挑选单克隆菌株；2）活化摇瓶：将配置有摇瓶培养基的活化摇瓶灭菌冷却后，接入终浓度50
‑
100ppm卡那霉素，挑取步骤1）中的平板单克隆1个接入25mL培养基/100mL摇瓶中；活化摇瓶培养4
‑
6h，OD
600
达0.6
‑
1.2；3）进罐摇瓶：将配置有摇瓶培养基的进罐摇瓶灭菌冷却后，接种同时加入终浓度50
‑
100ppm卡那霉素；按照接种量2%，取步骤2）的活化种子转接进入进罐摇瓶中，进罐摇瓶培养基体积60
‑
300mL；培养3
‑
4h，OD
600
达1.0
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘毅，蔡炯，肖凯，刘明霞，丁国中，宋旭，付玉洁，祁丽丽，张晋，肖阳，
申请(专利权)人：元本珠海横琴生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：