用于IGF-1基因重组表达的重组细胞和重组表达方法技术

本发明专利技术提供了用于IGF

【技术实现步骤摘要】
用于IGF
‑
1基因重组表达的重组细胞和重组表达方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及用于IGF
‑
1基因重组表达的重组细胞和重组表达方法。

技术介绍

[0002]胰岛素样生长因子(IGF)是一类广谱性促生长因子，其化学结构与胰岛素原类似，为同源的单链多肽，他们分子组成的氨基酸有70％是相同的。IGF在组织或血液中均与胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)相结合，以复合物的形式存在。血清中含有多种IGF，但到目前为止，已提纯的还只有两种，分别命名为IGF
‑
I和IGF
‑
II。这两者占血清中可提取的胰岛素样生长因子总量的90％以上，并且他们在促组织细胞生长发育中起主要作用。机体多种组织器官可以合成分泌IGF
‑
1，但最主要的器官是肝脏，约合成血液中80％的IGF
‑
1。另外，骨组织、其他组织和细胞也能合成少量IGF
‑
1。血液循环中的IGF
‑
1主要由肝脏分泌，但是它的表达却分布在所有组织中，暗示局部IGF
‑
1的自分泌和旁分泌可能是控制组织生长的主要机制。IGF
‑
1与生长发育、心脏生理和病理、糖尿病和骨质疏松密切相关，IGF
‑
1也成了身材矮小的儿童体检时必查的指标。
[0003]人的IGF
‑
1是由70个氨基酸组成的多肽链，有6个半胱氨酸(Cys)，形成三对链内二硫键，由于大肠杆菌细胞质是弱还原性，所以很难正确形成二硫键，因些通常采用信号肽将重组蛋白引导到大肠杆菌周质空间表达，然而信号肽引导重组蛋白进入周质空间的能力各有不同，且蛋白进入周质空间后，各种用于二硫键形成的酶含量很有限，所以重组蛋白进入周质空间后仍然难以大量积累，因此同时重组表达氧化还原酶和二硫键异构酶也非常重要。

技术实现思路

[0004]本专利技术中采用合适的信号肽，帮助四个酶SurA、Trx、DsbA和DsbC共同转化，使得SurA酶能够帮助脯氨酸形成正确构象，Trx、DsbA和DsbC酶能够正确形成二硫键，从而使IGF
‑
1在大肠杆菌细胞周质空间中能大量积累。因此，本专利技术第一个目的是提供一种用于IGF
‑
1基因重组表达的重组细胞，第二个目的是提供一种利用重组细胞诱导表达IGF
‑
1基因的方法。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种用于IGF
‑
1基因重组表达的重组细胞，所述重组细胞包含SP
‑
IGF1
‑
pET
‑
28b载体和质粒pATX
‑
4E，所述SP
‑
IGF1
‑
pET
‑
28b载体上包含有一种信号肽的基因，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述质粒pATX
‑
4E上包含有SurA、Trx、DsbA和DsbC的基因。
[0007]优选的，所述SP
‑
IGF1
‑
pET
‑
28b载体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0008]进一步优选的，所述SP
‑
IGF1
‑
pET
‑
28b载体的构建方法包括以下步骤：
[0009]A1、合成PCR扩增模板
[0010]将无信号肽基因的IGF
‑
1基因插入到pET
‑
21a载体的NdeI/XhoI酶切位点之间，得
到序列号如SEQ ID No.3所示的质粒IGF1
‑
pET
‑
21a作为PCR扩增模板；
[0011]A2、构建载体
[0012]用第一对引物扩增步骤A1中所述PCR扩增模板得到扩增产物P1；以P1为模板，用第二对引物对P1进行扩增得到扩增产物P2；以P2为模板，用第三对引物对P2进行扩增得到扩增产物P3；对P3进行无缝克隆，再插入到pET
‑
28b载体的NcoI/XhoI酶切位点之间，得到所述SP
‑
IGF1
‑
pET
‑
28b载体。
[0013]优选的，所述质粒pATX
‑
4E的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0014]进一步优选的，所述质粒pATX
‑
4E的构建方法包括如下步骤：
[0015]B1、构建过渡质粒骨架pACYC
[0016]用第四对引物扩增pACYCDuet
‑
1质粒得到扩增产物Q1，对Q1进行无缝克隆得到核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的过渡质粒骨架pACYC；
[0017]B2、构建质粒pATX
‑
1E
[0018]用第五对引物扩增DsbA的基因及启动子，对得到的扩增产物Q2进行无缝克隆，再插入到所述过渡质粒骨架pACYC的XhoI/HindIII酶切位点之间，得到核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的质粒pATX
‑
1E；
[0019]B3、构建质粒pATX
‑
2E
[0020]用第六对引物扩增包含有AmpR
‑
pelB
‑
Trx
‑
Myc基因的第一pUC57质粒，对得到的产物Q3进行无缝克隆，插入到所述质粒pATX
‑
1E的KpnI/EcoRI酶切位点之间，得到核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的质粒pATX
‑
2E；
[0021]B4、构建质粒pATX
‑
3E
[0022]用第七对引物扩增带Myc标签的SurA基因，得到扩增产物Q4；用第八对引物扩增Q4，得到扩增产物Q5；对Q5进行无缝克隆，插入到所述质粒pATX
‑
2E的EcoRI酶切位点处，得到核苷酸序列号如SEQ ID No.8所示的质粒pATX
‑
3E；
[0023]B5、构建质粒pATX
‑
4E
[0024]用第九对引物扩增包含有Myc
‑
DsbC
‑
Myc
‑
terminator基因的第二pUC57质粒，得到扩增产物Q6，对Q6进行无缝克隆，插入到所述质粒pATX
‑
3E的HindIII酶切位点处，得到所述质粒pATX
‑
4E。
[0025]本专利技术提供的重组表达IGF
‑
1基因的方法包括以下步骤：
[0026]C1、培养上述任一项所述的重组细胞；
[0027]C2、用IPT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于IGF
‑
1基因重组表达的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含SP
‑
IGF1
‑
pET
‑
28b载体和质粒pATX
‑
4E，所述SP
‑
IGF1
‑
pET
‑
28b载体上包含有一种信号肽的基因，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述质粒pATX
‑
4E上包含有SurA、Trx、DsbA和DsbC的基因。2.根据权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述SP
‑
IGF1
‑
pET
‑
28b载体的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。3.根据权利要求2所述的重组细胞，其特征在于，所述SP
‑
IGF1
‑
pET
‑
28b载体的构建方法包括以下步骤：A1、合成PCR扩增模板将无信号肽基因的IGF
‑
1基因插入到pET
‑
21a载体的NdeI/XhoI酶切位点之间，得到序列号如SEQ ID No.3所示的质粒IGF1
‑
pET
‑
21a作为PCR扩增模板；A2、构建载体用第一对引物扩增步骤A1中所述PCR扩增模板得到扩增产物P1；以P1为模板，用第二对引物对P1进行扩增得到扩增产物P2；以P2为模板，用第三对引物对P2进行扩增得到扩增产物P3；对P3进行无缝克隆，再插入到pET
‑
28b载体的NcoI/XhoI酶切位点之间，得到所述SP
‑
IGF1
‑
pET
‑
28b载体。4.根据权利要求1所述的重组细胞，其特征在于，所述质粒pATX
‑
4E的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述质粒pATX
‑
4E的构建方法包括如下步骤：B1、构建过渡质粒骨架pACYC用第四对引物扩增pACYCDuet
‑
1质粒得到扩增产物Q1，对Q1进行无缝克隆得到核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的过渡质粒骨架pACYC；B2、构建质粒pATX
‑
1E用第五对引物扩增DsbA的基因及启动子，对得到的扩增产物Q2进行无缝克隆，再插入到所述过渡质粒骨架pACYC的XhoI/HindIII酶切位点之间，得到核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的质粒pATX
‑
1E；B3、构建质粒pATX
‑
2E用第六对引物扩增包含有AmpR
‑
pelB
‑
Trx
‑
Myc基因的第一pUC57质粒，对得到的产物Q3进行无缝克隆，插入到所述质粒pATX
‑
1E的KpnI/EcoRI酶切位点之间，得到核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的质粒pATX
‑
2E；B4、构建质粒pATX
‑
3E用第七对引物扩增带Myc标签的SurA基因，得到扩增产物Q4；用第八对引物扩增Q4，得到扩增产物Q5；对Q5进行无缝克隆，插入到所述质粒pATX
‑
2E的EcoRI酶切位点处，得到核苷酸序列号如SEQ ID No.8所示的质粒pATX
‑
3E；B5、构建质粒pATX
‑
4E用第九对引物扩增包含有Myc
‑
DsbC

【专利技术属性】
技术研发人员：肖水冰，秦伏波，万定一，鲁亮，张永霞，代腾飞，
申请(专利权)人：普健生物武汉科技有限公司，
类型：发明
国别省市：