识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体、应用及单克隆纳米抗体文库制造技术

本发明专利技术公开了一种识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体、应用及单克隆纳米抗体文库，涉及猴痘病毒单克隆抗体制备技术领域。本发明专利技术提供的单克隆纳米抗体为A6、B8、G9、H9、E12共5条，这5条单克隆纳米抗体重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体、应用及单克隆纳米抗体文库


[0001]本专利技术涉及猴痘病毒单克隆抗体制备
，特别涉及识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体文库、构建方法、单克隆纳米抗体及应用。

技术介绍

[0002]猴痘病毒(Monkeypox virus，MPXV)是一种正痘病毒，外形为圆角砖形或卵圆形，大小为200
‑
400nm；外部有脂蛋白膜，中间具有两个含蛋白质的侧体，有1个厚膜核心，核心内含很大的双链DNA基因体。
[0003]猴痘病毒蛋白A29L是细胞内成熟病毒(IMV)表面包膜蛋白，与牛痘病毒VACV、A27同源，此蛋白能与细胞表面上的硫酸乙酰肝素(Heparan Sulfate)作用使病毒跟细胞结合并且可催化细胞融合。因为该蛋白为病毒表面包膜蛋白，针对其的特异性单克隆抗体，可用于通过结合A29L蛋白来识别猴痘病毒，最终达到检测血清或者其他待测样本中的猴痘病毒的目的。
[0004]噬菌体展示技术是利用噬菌粒载体或噬菌体载体，将多肽或蛋白质的编码基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源多肽或者蛋白与特定的噬菌体衣壳蛋白融合表达，展示在噬菌体表面的一种技术。纳米抗体是一种在羊驼外周血液中存在的天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，这种单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是已知的可结合目标抗原的最小单位。
[0005]针对猴痘病毒，利用噬菌体展示技术展示获得高亲和力的单克隆纳米抗体，具有非常广阔的应用前景。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体，应用及单克隆纳米抗体文库。本专利技术通过利用噬菌体展示技术，构建能够展示单克隆纳米抗体的噬菌体文库，再以A29L蛋白为靶点蛋白，通过淘选/筛选的方法对该文库进行体外富集淘选和单克隆高通量ELISA筛选，最终获得了5条特异性识别猴痘核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体，并最终通过抗体配对ELISA检测的方法，验证了这些抗体能够识别A29L蛋白上的不同抗原决定簇，可用于开发开发针对于猴痘病毒检测的双抗夹心法酶联免疫试剂盒。具体通过以下技术实现。
[0007]一种识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体，为单克隆纳米抗体A6、B8、G9、H9或E12；所述单克隆纳米抗体A6的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1
‑
3所示；
[0008]所述单克隆纳米抗体B8的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4
‑
6所示；
[0009]所述单克隆纳米抗体G9的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7
‑
9所示；
[0010]所述单克隆纳米抗体H9的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10
‑
12所示；
[0011]所述单克隆纳米抗体E12的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.13
‑
15所示。
[0012]优选地，所述单克隆纳米抗体A6的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述单克隆纳米抗体B8的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；所述单克隆纳米抗体G9的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；所述单克隆纳米抗体H9的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；所述单克隆纳米抗体E12的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。
[0013]更优选地，所述单克隆纳米抗体A6的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.21
‑
22所示；
[0014]所述单克隆纳米抗体B8的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.23
‑
24所示；
[0015]所述单克隆纳米抗体G9的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.25
‑
26所示；
[0016]所述单克隆纳米抗体H9的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.27
‑
28所示；
[0017]所述单克隆纳米抗体E12的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.29
‑
30所示。
[0018]优选地，编码所述单克隆纳米抗体A6、B8、G9、H9或E12的基因序列如SEQ ID NO.31
‑
35所示。
[0019]本专利技术还提供了上述单克隆纳米抗体在ELISA方法检测猴痘病毒中的应用。
[0020]优选的，在应用时采用双抗体夹心ELISA方法检测猴痘病毒，以所述单克隆纳米抗体H9作为(酶标板的)包被抗体，以生物素标记的单克隆纳米抗体B8作为生物素标记抗体进行检测。
[0021]本专利技术还提供了一种识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体文库，该文库用于筛选获得上述的单克隆纳米抗体，具体是通过提取经过猴痘病毒免疫后的天然羊驼PBMCs细胞的总RNA，采用反转录和PCR扩增的方法获得抗体可变区VHH的基因序列，将基因序列连接到噬菌体表达载体上，转化至感受态细胞中得到。
[0022]一种本专利技术提供的上述单克隆纳米抗体文库的构建方法，包括以下步骤：
[0023]S1、提取经过猴痘病毒免疫后的天然羊驼PBMCs细胞的总RNA，反转录得到cDNA；
[0024]S2、以步骤S1的cDNA为模板，PCR扩增获得抗体可变区VHH的基因序列，电泳回收300
‑
500bp大小的目的片段；
[0025]S3、将步骤S2回收的目的片段和噬菌体表达载体用SfiI和NotI双酶切，在T4连接酶作用下将目的片段连接至噬菌体表达载体上，得到重组噬菌体表达载体；
[0026]S4、将步骤S3的噬菌体表达载体转入到感受态细胞中，培养过夜得到单克隆纳米抗体文库。
[0027]本专利技术还提供了上述单克隆纳米抗体文库在噬菌体展示方法筛选识别猴痘病毒
核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体的应用，将构建成功的纳米抗体文库通过辅助噬菌体拯救为展示在噬菌体衣壳表面的形式之后，以猴痘病毒核心蛋白A29L作为抗原通过吸附
‑
洗脱的方法进行淘选，筛选出与猴痘病毒核心蛋白A29L特异性结合的阳性孔混合液，然后采用夹心ELISA法对所述阳性孔混合液进行检测，用猴痘病毒核心蛋白A29L作为抗原，选择抗原组OD
600
值大于0.5，且对照组OD
600
值小于0.15的克隆定为阳性克隆，去除错误抗体序列和重复抗体序列，得到高特异性识别猴痘病毒核心蛋白A29L的VHH纳米抗体。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体，其特征在于，为单克隆纳米抗体A6、B8、G9、H9或E12；所述单克隆纳米抗体A6的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1
‑
3所示；所述单克隆纳米抗体B8的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4
‑
6所示；所述单克隆纳米抗体G9的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.7
‑
9所示；所述单克隆纳米抗体H9的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10
‑
12所示；所述单克隆纳米抗体E12的重链的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.13
‑
15所示。2.根据权利要求1所述的识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体，其特征在于，所述单克隆纳米抗体A6的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述单克隆纳米抗体B8的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；所述单克隆纳米抗体G9的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示；所述单克隆纳米抗体H9的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；所述单克隆纳米抗体E12的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO.20所示。3.根据权利要求2所述的识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克隆纳米抗体，其特征在于，所述单克隆纳米抗体A6的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.21
‑
22所示；所述单克隆纳米抗体B8的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.23
‑
24所示；所述单克隆纳米抗体G9的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.25
‑
26所示；所述单克隆纳米抗体H9的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.27
‑
28所示；所述单克隆纳米抗体E12的恒定区CH2和CH3的氨基酸序列如SEQ ID NO.29
‑
30所示。4.根据权利要求1所述的识别猴痘病毒核心蛋白A29L的单克...

【专利技术属性】
技术研发人员：方绪凤，段静，杨查理，秦伏波，鲁亮，万定一，代腾飞，张永霞，
申请(专利权)人：普健生物武汉科技有限公司，
类型：发明
国别省市：