本发明专利技术提供了一种抗AAV5抗体，以及包含所述抗体的快速AAV5滴度测定ELISA试剂盒。具体地，本发明专利技术提供了一种高特异性结合AAV5病毒颗粒/AAV5载体的单克隆抗体，其不与变性解聚的VP1、VP2和/或VP3亚基结合，且不与AAV2，6，8，9血清型结合。基于该抗体制备的快速AAV5滴度测定ELISA试剂盒具有4E+09capsids/ml～6.25E+07capsids/ml的线性范围，灵敏度达到3E+07capsids/ml，且具有较好的精密度，可应用于基因治疗的AAV5载体滴度测定。基因治疗的AAV5载体滴度测定。
【技术实现步骤摘要】
抗AAV5抗体及快速AAV5滴度测定ELISA试剂盒
[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种抗AAV5抗体，以及包含所述抗体的快速AAV5滴度测定ELISA试剂盒。
技术介绍
[0002]腺相关病毒(AAV)作为基因治疗递送载体具有较高的安全性和临床价值，已成为体内基因导入的主要平台之一。美国FDA于2017年批准了基因治疗药物Luxturna用于治疗遗传性视网膜疾病，2019年批准了Zolgensma用于治疗脊髓性肌萎缩症，两款药物分别采用AAV2，AAV9载体进行基因递送。2022年欧盟批准上市了两款AAV基因治疗药物，Upstaza治疗AADC缺乏症，Roctavian治疗重度A型血友病成人患者，分别采用AAV2，AAV5载体进行基因递送。
[0003]国际病毒学会将AAV划分为两个种属，其中AAV1
‑
4和AAV6
‑
13属于腺相关依赖性病毒A，AAV5属于腺相关依赖性病毒B[1]。AAV病毒粒子由60个VP亚基组成，组装衣壳的三个结构蛋白VP1:VP2:VP3的比例为1:1:10。VP1，2，3只在蛋白的N端序列上有差异，VP1，2都含有VP3的氨基酸序列，同时N端还有额外的其它氨基酸序列。AAV的序列和结构决定了不同血清型AAV与宿主细胞受体结合作用的差异，导致不同血清型的AAV对不同的组织和细胞感染效率不同，具有组织趋向性，AAV5对肺，眼，神经系统表现出一定亲和性。AAV5与其它血清型的衣壳蛋白同源性低，约为55％[2,3]。
[0004]对于治疗型AAV载体，准确的滴度测定是AAV基因治疗药物质控的重要组成部分，稳定可靠的滴度才能保证准确给药剂量。AAV的物理滴度一般是指基因组滴度或者衣壳滴度。基因组滴度常采用qPCR、Digital droplet PCR(ddPCR)检测，qPCR由于样品制备，引物设计，PCR效率等差异，不同批次不同实验室会产生实验偏差，ddPCR虽然能克服一些qPCR的局限，不同样品处理方法仍然会产生偏差。衣壳滴度主要是通过ELISA方法进行检测，ELISA方法具有可靠及重现性好的优点。对于应用于基因治疗的不同血清型的AAV载体，尤其是经过序列结构优化改造的AAV载体，都有需求开发出特异性抗体作为捕获和检测抗体，以ELISA方法测定AAV滴度[4]。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于提供一种特异性结合AAV5病毒颗粒/AAV5载体上衣壳蛋白构象表位的抗体，以及使用所述抗AAV5抗体制备得到具有高灵敏度、高精密度的快速AAV5滴度测定ELISA试剂盒。
[0006]本专利技术的第一方面，提供了一种抗AAV5抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含以下3个CDR：
[0007]SEQ ID NO:3所示的H
‑
CDR1；
[0008]SEQ ID NO:4所示的H
‑
CDR2；
[0009]SEQ ID NO:5所示的H
‑
CDR3；以及
[0010]所述轻链可变区包含以下3个CDR：
[0011]SEQ ID NO:6所示的L
‑
CDR1；
[0012]序列如LAS所示的L
‑
CDR2；
[0013]SEQ ID NO:7所示的L
‑
CDR3。
[0014]在另一优选例中，所述重链可变区还包含鼠源的FR区，以及所述的轻链可变区还包含鼠源的FR区。
[0015]在另一优选例中，所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列。
[0016]在另一优选例中，所述抗体的轻链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％(优选地至少95％，96％，97％，98％，99％)序列同一性的氨基酸序列。
[0017]在另一优选例中，所述抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的重链可变区，和/或氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区。
[0018]在另一优选例中，所述抗体还包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
[0019]在另一优选例中，所述重链恒定区和/或轻链恒定区为鼠源的或人源的。
[0020]在另一优选例中，所述重链恒定区来源于小鼠重链IgG1，和/或所述轻链恒定区来源于小鼠kappa(κ)链。
[0021]在另一优选例中，所述重链恒定区包含如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
[0022]在另一优选例中，所述轻链恒定区包含如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
[0023]在另一优选例中，所述抗体包括：单克隆抗体、多克隆抗体、双链抗体、单链抗体(scFv)、Fab、Fab'、F(ab')2抗体。
[0024]在另一优选例中，所述抗体为双链抗体，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的重链，以及氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的轻链。
[0025]在另一优选例中，所述抗体包括动物源抗体(例如不同亚型的鼠源抗体)、嵌合抗体(例如人
‑
鼠嵌合抗体)。
[0026]在另一优选例中，所述抗体仅特异性结合完整的AAV5病毒颗粒，不结合变性解聚的VP1、VP2和/或VP3亚基。
[0027]本专利技术的第二方面，提供了一种重组抗体，所述的重组抗体具有：
[0028](i)如本专利技术第一方面所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段的序列；以及
[0029](ii)任选的促进抗体分泌表达的信号肽和/或纯化、检测的标签序列。
[0030]在另一优选例中，所述的标签序列选自下组：FLAG、Myc、His标签等。
[0031]本专利技术的第三方面，提供了一种多核苷酸分子，其编码选自下组的多肽：
[0032](1)如本专利技术第一方面所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段；或
[0033](2)如本专利技术第二方面所述的重组抗体。
[0034]在另一优选例中，所述多核苷酸分子包含如SEQ ID NO:12和/或SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
[0035]本专利技术的第四方面，提供了一种表达载体，其含有本专利技术第三方面所述的多核苷酸分子。
[0036]在另一优选例中，所述载体包括真核细胞表达载体、原核细胞表达载体。
[0037]本专利技术的第五方面，提供了一种宿主细胞，其含有如本专利技术第四方面所述的载体，
或基因组中整合有如本专利技术第三方面所述的多核苷酸分子。
[0038]在另一优选例中，所述宿主细胞包括真核细胞(如哺乳动物细胞)、原核细胞。
[0039]本专利技术的第六方面，提供了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包含：
[0040](a)如本专利技术第一方面所述的抗AAV5抗本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种抗AAV5抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含以下3个CDR：SEQ ID NO:3所示的H
‑
CDR1；SEQ ID NO:4所示的H
‑
CDR2；SEQ ID NO:5所示的H
‑
CDR3；以及所述轻链可变区包含以下3个CDR：SEQ ID NO:6所示的L
‑
CDR1；序列如LAS所示的L
‑
CDR2；SEQ ID NO:7所示的L
‑
CDR3。2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区包含如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的轻链可变区包含如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或与其具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。4.一种重组抗体，其特征在于，所述的重组抗体具有：(i)如权利要求1所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段的序列；以及(ii)任选的促进抗体分泌表达的信号肽和/或纯化、检测的标签序列。5.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物包含：(a)如权利要求1
‑
3任一项所述的抗AAV5抗体或其抗原结合片段或如权利要求4所述的重组抗体；和(b)偶联部分，所述偶联部分包括：可检测标记物、或酶。6.如权利要求1
‑
3任一项所述抗AAV5抗体或其抗原结合片段、如权利要求4所述的重组抗体或如权利要求5所述的抗体偶联物在制备用于检测AAV5病毒颗粒/AAV5载体的检测试剂、检测板或试剂盒中的用途。7.一种检测试剂，所述检测试剂包括：如权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：程智，徐万熙，冉晓园，
申请(专利权)人：恺佧生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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