一种IL-31RA抗体以及其构建方法技术

一种IL

【技术实现步骤摘要】
一种IL
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31RA抗体以及其构建方法


[0001]本专利技术涉及一种IL
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31RA抗体以及其构建方法

技术介绍

[0002]现有的IL
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31RA抗体由于序列本身设计的缺陷，以及构建方法的不足，导致最终得到的抗体活性较低，作为对照品、检测试剂，其抗原结合特异性以及抗体活性都有一定不足。而且，目前表达抗体传统的方法是把重链和轻链分别构建到两个哺乳表达载体上，然后利用含有重链和轻链的两个表达载体进行共转来实现抗体的表达。该传统方法具有一定的局限性，比如由于两个载体同时转染到细胞中，不同表达载体间有相互抑制作用，或是转染入细胞的两个质粒的量的比例不合适而导致抗体表达失败，同时构建多个载体也不经济。

技术实现思路

[0003]本专利技术涉及一种IL
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31RA抗体
[0004]所述抗体重链包括SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的CDR1、CDR2、CDR3，所述抗体轻链包括SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所述的CDR1、CDR2、CDR3。
[0005]所述抗体重链可变区如SEQ ID NO.3所示，所述抗体重链全长如SEQ ID NO.2所示，所述抗体重链全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0006]作为优选，在抗体设计时在重链的C端增加Avi标签，重链和Avi标签之间通过GS Linker连接，提高了融合表达的效率(已经包含在SEQ ID NO.2所示的全长序列中)。
[0007]进一步的，所述抗体轻链可变区如SEQ ID NO.9所示，所述抗体轻链全长如SEQ ID NO.8所示，所述抗体轻链全长核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0008]所述Avi标签蛋白序列为SEQ ID NO.15所示，GS Linker序列并不限定，可以为本领域通用的GS linker，但优选为SEQ ID NO.16所示。
[0009]本专利技术自主筛选得到的IL
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31RA抗体序列，可最大程度发挥抗原特异性。
[0010]本专利技术还涉及一种抗体构建方法，把抗体IL31RA的重链和轻链基因通过基因合成的方法同时构建到哺乳表达载体pTT5上，重链和轻链基因之间用2A肽连接。所述构建载体包括顺次连接的启动子
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抗体轻链
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2A Linker
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抗体重链
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终止子的功能元件。(结构图参见图7)
[0011]所述2A肽的核苷酸序列为SEQ ID NO.13所示，所述2A肽的蛋白序列为SEQ ID NO.14所示。
[0012]所述抗体序列，配合特定的构建方法，能够起到协同增效的作用，可最大程度提高抗体活性和特异性。
附图说明
[0013]图1同源重组的方法把重链和轻链基因重组到哺乳表达载体pTT5重构建重组抗体
IL31RA表达载体环状图；
[0014]图2同源重组的方法把重链和轻链基因重组到哺乳表达载体pTT5重构建重组抗体IL31RA表达载体线型图；
[0015]图3重组抗体IL31RA表达载体质粒酶切图；
[0016]图4重组质粒转染结果图；
[0017]图5重链和轻链分别构建质粒表达结果；
[0018]图6重链和轻链通过P2A同时构建在一个哺乳表达载体上的表达结果；
[0019]图7重组载体结构示意图。
[0020]有益效果
[0021]1.本专利技术对抗体序列进行了优化，序列结构上筛选改进；并且为了提高表达效率，再抗体重链的C端加上Avi标签，并且在重链和Avi标签直接通过GS linker连接，便于融合表达，因此提高了活性。
[0022]2.本专利技术通过把IL31RA抗体重链和轻链同时构建到一个哺乳表达载体上，重链和轻链之间需要加上2A肽，重链和轻链通过2A多肽链连成一个ORF，mRNA翻译成一个融合蛋白，最后这两个融合蛋白会被识别2A的蛋白酶切成两个蛋白，即表达后的重链和轻链会被切开，重链和轻链的摩尔比理论上是1：1。相对于分别构建两个表达载体的传统方法，还需要摸索合适的比例，而该方法只需要构建一个表达载体进行单个转染实验即可，节约时间和试剂成本，因此该方法即高效又经济，有利于产业化放大。
具体实施方式
[0023]实施例一构建重组抗体IL31RA表达载体
[0024]1.1设计引物
[0025]使用引物设计工具GeneDesign设计重组抗体IL31RA的重链和轻链的引物，设计得到的引物委托引物合成供应商生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。
[0026]1.2引物PCR扩增得到重链和轻链DNA片段
[0027]接到生工生物工程(上海)股份有限公司合成的引物后通过两轮PCR实验得到重组抗体IL31RA重链和轻链的DNA片段：
[0028]第I轮PCR反应体系
[0029][0030]第I轮PCR反应程序
[0031][0032]第II轮PCR反应体系
[0033][0034]第II轮PCR反应程序
[0035][0036]扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定所扩增的重链和轻链DNA片段大小正确，从琼脂糖凝胶上切下大小正确的DNA片段，利用凝胶回收试剂盒纯化回收得到重链和轻链DNA片段。
[0037]1.3重组抗体IL31RA重链和轻链的DNA片段克隆至表达载体pTT5
[0038]把已经纯化好的重链和轻链的DNA片段使用同源重组的方法重组进pTT5表达载体，载体使用EcoRI和HindIII这两个限制性酶切位点进行酶切线性化，同源重组反应如下：
[0039]1.1.1同源重组反应体系：
[0040][0041]重组反应液在50℃反应30min后得到的产物转化进DH5a感受态，转化后的感受态置于冰上冰浴15min，冰浴完成后于42℃水浴锅里热激90s，热激完之后立刻插入冰上冰育2
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3min，在超净台中，加入500μL LB培养基(注意一定是无抗的LB培养基)，轻柔的上下颠倒3
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5次，37℃、230rpm震荡培养45
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60min。涂板，37℃恒温箱培养过夜。
[0042]1.4重组抗体IL31RA重链和轻链阳性克隆筛选
[0043]生长过夜的平板挑取单克隆进行菌落PCR，菌落PCR体系：
[0044][0045]反应程序：
[0046][0047][0048]菌液PCR反应结束后电泳跑检测胶，以确认是否扩增成功，如果有相应大小的目的条带，为阳性克隆，把阳性克隆菌液送给生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证；
[0049]利用全基因合成方法合成重组抗体IL31RA的轻链和重链基因，通过同源重组的方法把重链和轻链基因本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种IL
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31RA抗体，其特征在于，所述抗体重链包括SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的CDR1、CDR2、CDR3，所述抗体轻链包括SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所述的CDR1、CDR2、CDR3。2.权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链可变区如SEQ ID NO.3所示，所述抗体轻链可变区如SEQ ID NO.9所示。3.权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链的C端通过GS linker与Avi标签序列连接。4.权利要求3所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链全长蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，所述抗体轻链全长蛋白序列如SEQ ID NO.8所示。5.权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述抗体轻链...

【专利技术属性】
技术研发人员：林立，杨佩，方斌，王刚，
申请(专利权)人：恺佧生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：