一种生产A82846B的基因工程菌及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种生产A82846B的基因工程菌，所述高产A82846B的基因工程菌株为荒漠拟孢囊菌SIPI

【技术实现步骤摘要】
一种生产A82846B的基因工程菌及其制备方法


[0001]本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种生产A82846B的基因工程菌及其构 建/制备方法与应用。

技术介绍

[0002]随着抗菌药物应用的增多，细菌的耐药性问题日益严重，耐甲氧西林金黄色 葡萄球菌(Methicillin
‑
resistant Staphylococcus aureus，MRSA)在皮肤感染中的比例逐 年上升。临床通常使用糖肽类抗生素万古霉素和替考拉宁等治疗由MRSA引起的 严重感染。然而，耐万古霉素菌株的迅速出现，使得寻找新型抗MRSA抗菌药物 迫在眉睫。2014年8月6日，The Medicines公司开发的新型糖肽类抗菌药物奥利 万星获美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市，商品名为Orbactiv。该药用于治 疗由敏感革兰阳性菌(包括MRSA)引起的急性细菌性皮肤和皮肤结构感染的首个 和唯一一种单剂量治疗方案的抗生素。奥利万星(Oritavancin)是在第一代糖肽抗生 素的基础上开发的第二代糖肽抗生素，其作用机制是通过阻断肽聚糖生物合成时 转糖苷作用抑制细菌细胞壁的形成。故该类化合物对细菌细胞具有高度的特异性， 能迅速杀灭细菌而对人体正常细胞影响较小，因而疗效好，安全性高。
[0003]A82846B是奥利万星的合成前体，分子式是C
86
H
97
Cl2N
10
O
26
，它的结构与多 数糖肽类抗生素的结构类似，是万古霉素的结构相类似。目前，大规模微生物发 酵法是生产A82846B的主要方式，发酵液还会有A82846A和A82846C产生。 A82846A和A82846C都是A82846B的结构类似物，三者的结构式如下式1所示， 三者的区别在于糖肽骨架的2位和6位氨基酸残基的取代基上的氯原子，A82846B 在2和6位取代基上各有一个氯原子，A82846A只在2位取代基有一个氯原子， A82846C没有氯原子(表1)。由于发酵液中A82846A和A82846C产生，给A82846B 的生产和后续的分离纯化增加了成本。由式可知，三种物质结构非常接近，分离 纯化工作比较困难。目前，关于奥利万星关键中间体A82846B提取分离的文献报 道较少。欧洲专利EP0280570A2及美国专利US4845194公开了三种物质的分离方 法，其中A82846B的分离方法为：将发酵液通过阳离子(NH
4+
)交换树脂进行初 步富集，然后通过制备性高效液相色谱柱分离，最后经过HP20ss树脂精制。专利 中主要进行了此3步纯化，后面的两个步骤的收率仅为29％，总收率更低。
[0004][0004][0005]因此，通过构建新的生产A82846B的发酵菌株，从而减少发酵过程中结构类 似物的含量，从而降低生产成本，简化操作步骤，降低环境污染，提高收率，满 足工业化生产的需求。

技术实现思路

[0006]本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术中上述A82846B发酵过程中，副产 物A82846A和A82846C产生，减少生产A82846B及其分离纯化的时间和经济成 本；提供一种生产A82846B的高产低杂基因工程菌及其构建方法和应用，可以利 用基因工程技术提高生产A82846B的效率，降低成本。
[0007]随着分子生物学技术的发展，利用基因工程手段能够定向改造或修饰抗生素 的生物合成基因簇，获得新型抗生素或提高抗生素产量。然而，本专利技术的难点在 于A82846B目标产物及其副产物A82846A和A82846C的产生在其生产菌中的基 因调控机理尚未清楚，特别是A82846A、A82846B与A82846C间的相互转化，以 及与其内部存在的卤化酶的关系均不清楚。本专利技术通过诸多研究和试验，发现将 内源卤化酶基因或糖基转移酶A基因导入产A82846B的宿主菌，使之过表达，获 得的工程菌产物中各物质的含量发生了变化，副产物A82846A和A82846C的产量 和/或比例显著降低，和/或A82846B产量和/或比例明显提高。
[0008]因此，本专利技术的技术方案之一是：一种生产A82846B的基因工程菌，其特征 在于，其是在生产A82846B的出发菌荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)的 基因组中同源重组整合了人工构建的attB位点，同时整合了内源卤化酶基因orf10 和内源性糖基转移酶A基因orf11的基因工程菌。
[0009]优选的，所述attB位点是同源重组插入的人工合成的外源基因片段。所述卤 化酶基因orf10和糖基转移酶基因orf11来源于自身基因。
[0010]本专利技术在一较佳实施例中，是在宿主菌SIPI
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3927中导入一个人工构建的attB 位点，构建含attB位点的pKC1139
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attB同源重组质粒，经过双交换筛选获得新宿 主菌SIPI
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3927
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attB，其特征在于插入一个人工attB位点。
[0011]本专利技术在一较佳实施例中，是在新宿主菌SIPI
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3927
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attB中导入荒漠拟孢囊菌 的卤化酶基因orf10，使卤化酶过表达。
[0012]本专利技术在一较佳实施例中，是在新宿主菌SIPI
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3927
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attB中导入荒漠拟孢囊菌 的糖基转移酶A基因orf11，使糖基转移酶过表达。
[0013]本专利技术在一较佳实施例中，是在新宿主菌SIPI
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3927
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attB中导入荒漠拟孢囊菌 的卤化酶基因orf10和糖基转移酶A基因orf11，使卤化酶和糖基转移酶同时过表 达。
[0014]更优选的，所述的卤化酶基因orf10优选来源于荒漠拟孢囊菌SIPI
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3927菌株， 其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述糖基转移酶A基因orf11是来源于荒漠拟 孢囊菌SIPI
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3927菌株，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；attB的核苷酸序列如 SEQ ID No.3所示；同源重组质粒pKC1139
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attB核苷酸序列如SEQ ID No.4所示； 过表达质粒pSET152
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orf10
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orf11核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
[0015]本专利技术所述的基因工程菌为荒漠拟孢囊菌SIPI
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3927
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D20(Kibdelosporangiumaridum),保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.19794。
[0016]本专利技术的再一技术方案是：一种本专利技术上述基因工程菌的制备方法，所述制 备方法包括下列步骤：
[0017]1)PCR人工合成attB的全基因；
[0018]2)构建含attB的同源重组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产A82846B的基因工程菌，其特征在于，其是在生产A82846B的出发菌荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)的基因组中同源重组整合了人工构建的attB位点，同时整合了内源卤化酶基因orf10和内源性糖基转移酶A基因orf11的基因工程菌。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述attB位点是同源重组插入的人工合成的外源基因片段。所述卤化酶基因orf10和糖基转移酶基因orf11来源于自身基因。3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的卤化酶基因orf10的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，orf11的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，attB的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，同源重组质粒pKC1139
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attB核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，质粒pSET152
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orf10
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orf11核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，基因工程菌为荒漠拟孢囊菌SIPI
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3927
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D20(Kibdelosporangium aridum),保藏于中国微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.19794。5.一种如权利要求1
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4任一项所述基...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡海峰，田勋，
申请(专利权)人：中国医药工业研究总院，
类型：发明
国别省市：