一种MNR2蛋白的纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种高效的MNR2蛋白纯化工艺，所述的MNR2蛋白带有MBP标签，所述的纯化工艺采用两步纯化，第一步为MBP亲和纯化，第二步为capto Q ImpRes柱与capto adhere柱串联纯化，强阴离子柱即capto Q ImpRes柱在上，强阴离子复合柱即capto adhere柱在下，或者强阴离子柱即capto Q ImpRes柱在前，强阴离子复合柱即capto adhere柱在后，中间使用柱子连接件进行串联。本发明专利技术能够极大提高工作效率，两步纯化改为一步纯化，节省每步纯化时间与各种纯化buffer配置时间，以及节省相关试剂。且操作简单化，并且相关检测指标能优于其他纯化方式，满足药品相关指标要求；另外，多增加一步纯化即意味着增加损失，一步纯化可以减少损失，明显提高产品收率，各项检测指标都能满足中国药典相关要求；此外非常便于纯化放大。此外非常便于纯化放大。此外非常便于纯化放大。

【技术实现步骤摘要】
一种MNR2蛋白的纯化方法


[0001]本专利技术属于蛋白纯化
，具体来说，本专利技术涉及一种MNR2蛋白的纯化方法。

技术介绍

[0002]最新统计数据显示，2020年全球新发癌症病例1929万例，全球癌症死亡病例996万例；2020年中国新发癌症病例457万例，中国癌症死亡病例300万例。在全球范围内，由于人口老龄化的加剧，预计2040年相比2020年，癌症负担将增加50％，届时全新新发癌症病例数将达到近3000万。这在正经历社会和经济转型的国家中最为显著。
[0003]癌症治疗药物的研究是当今国际研究热点。癌症治疗传统手段是手术、化疗及放疗，而生物免疫治疗近年来发展迅速，特别是疫苗治疗癌症应用方便，效果显著，深受广大患者欢迎。接种肿瘤疫苗是免疫治疗方法中的一种，其原理是利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体产生特异性细胞免疫和体液免疫反应，即激活患者自身的免疫系统，来增强机体的抗癌能力，进而阻止肿瘤的生长、扩散和复发，最终达到控制甚至清除肿瘤的目的。接种肿瘤疫苗可以在肿瘤发生的早期就可以高效、特异地清除肿瘤，而且不良反应小。此外，肿瘤疫苗治疗也可与手术治疗、放疗及化疔相结合，在综合治疗肿瘤中占有重要地位。
[0004]MNR2癌症疫苗的研究开发，给广大癌症患者、家庭、国家带来福音。MNR2蛋白基因整合MBP标签蛋白基因，经基因重组大肠杆菌表达而来，经过菌体离心、破碎、过滤等程序以及后续蛋白纯化等步骤，得到符合药品生产各项指标的蛋白原液。而产品的收率、纯度、最终成药质量水平等主要由纯化步骤决定。
[0005]针对MNR2蛋白，现有通用的纯化方案至少需要三步纯化：第一步MBP亲和层析纯化，去除大部分杂蛋白；第二步纯化一般选择阴离子柱或者阳离子层析，例如capto adhere柱与capto Q ImpRes，或者capto SP ImpRes柱，去除残留杂蛋白，以及宿主蛋白与宿主DNA；第三步一般选用Sepharose Q Fast Flow填料层析去除内毒素；因此，按照现有技术的通用纯化方案，至少需要三步纯化才能得到相对符合相关标准的MNR2蛋白。
[0006]现有通用的纯化方案存在如下技术问题：第一步MBP亲和层析纯化之后，需要配置后续至少两步纯化的若干种buffer，耗费时间与相关纯化试剂；同时至少需要再纯化两步，即重复的平衡、上样、洗杂、洗脱、洗柱等多步纯化操作工序，且洗柱工序一般还包括2M氯化钠清洗3
‑
5柱体积、纯化水清洗3
‑
5倍柱体积、20％乙醇清洗3
‑
5倍柱体积后液封；造成重复操作，导致纯化操作效率低下；同时因为两步纯化带来损失，收率也会随之下降。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种高效的MNR2蛋白的纯化方法。
[0008]专利技术人经过大量的实验研究，意外发现将2根层析柱串联使用，强阴离子柱即capto Q ImpRes柱在上，强阴离子复合柱即capto adhere柱在下，或者强阴离子柱即capto Q ImpRes柱在前，强阴离子复合柱即capto adhere柱在后，根据层析柱不同规格，中间采用直接插入连接、或者1/16两端外螺纹两通连接件连接、或者1/16两端内螺纹两通连接件进
行串联；仅进行一步纯化，取代原亲和层析之后，至少两步纯化的工艺，即仅需要一次洗柱、平衡、上样、洗杂、洗脱、柱子再生、清洗、20％乙醇液封等工序，避免重复的纯化操作步骤，且纯化后样品检测结果达到甚至超出两步纯化的效果，检测结果符合药品相关指标。
[0009]本专利技术的技术方案如下：
[0010]一种MNR2蛋白纯化工艺，所述的MNR2蛋白为带有MBP标签的MNR2蛋白，编码带有MBP标签的MNR2蛋白的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；
[0011]所述的MNR2蛋白由基因工程菌表达，所述的基因工程菌转化有含编码MBP标签的基因和编码MNR2蛋白的基因的重组质粒表达载体；
[0012]本专利技术中，质粒表达载体选用pET26b(+)大肠杆菌表达载体，宿主菌选用E.coli BL21(DE)3宿主菌。
[0013]所述的纯化工艺采用两步纯化，第一步为MBP亲和纯化，第二步为capto Q ImpRes柱与capto adhere柱串联纯化，强阴离子柱即capto Q ImpRes柱在上，强阴离子复合柱即capto adhere柱在下，或者强阴离子柱即capto Q ImpRes柱在前，强阴离子复合柱即capto adhere柱在后。
[0014]优选地，
[0015]本专利技术的MNR2蛋白纯化工艺，具体包括以下步骤：
[0016]1)将表达目标蛋白MNR2的大肠杆菌基因工程菌进行发酵与诱导表达，再将发酵后的大肠杆菌菌液离心获得菌泥；
[0017]2)将步骤1)的菌泥溶解于缓冲液，破碎处理得破碎料液，离心收集上清液，将上清液过滤，得到含有目标蛋白MNR2的滤液；
[0018]3)MBP亲和层析后得到一步纯化后样品；
[0019]4)样品稀释：用低盐buffer将步骤3)的MBP亲和层析洗脱后的样品稀释2.5倍，即样品体积与低盐buffer体积比为1：1.5；同时配备5％浓度高低盐buffer，即将高盐buffer与低盐buffer按照体积比为5：95混合待用；
[0020]5)层析柱串联：串联连接capto Q ImpRes层析柱与capto adhere层析柱，强阴离子柱即capto Q ImpRes柱在上，强阴离子复合柱即capto adhere柱在下，或者强阴离子柱即capto Q ImpRes柱在前，强阴离子复合柱即capto adhere柱在后，连接到纯化仪柱位阀上；
[0021]6)洗柱与平衡：根据不同规格层析柱，流速调节2.0
‑
10mL/min；用5
‑
10倍柱体积的超纯水洗柱，再用3
‑
5倍柱体积的0.5M氢氧化钠或者2M氯化钠清洗柱子，再用5
‑
10倍柱体积的超纯水洗柱，再用3
‑
5倍柱体积的5％浓度高低盐buffer平衡柱子，纯化仪测得电导率值约为6
‑
8ms/cm，UV值与电导率值基本无波动，UV值校准为0；
[0022]7)上样与除杂：将步骤4)的稀释后的样品上样，根据不同规格层析柱，流速调节2.0
‑
10mL/min；纯化仪测得电导率值约为6
‑
8ms/cm，上样结束后，用3
‑
5倍柱体积的5％浓度高低盐buffer洗杂，此处的5％浓度高低盐buffer为步骤4)配备好的高低盐buffer；
[0023]8)蛋白洗脱与收集：先拆除capto Q ImpRes柱，再对capto adhere柱进行蛋白洗脱，洗脱梯度设置为20％
‑
25％高低盐梯度洗脱，纯化仪测得洗脱电导率值范围15<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种MNR2蛋白纯化工艺，其特征在于，所述的MNR2蛋白为带有MBP标签的MNR2蛋白，编码带有MBP标签的MNR2蛋白的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.37所示；所述的MNR2蛋白由基因工程菌表达，所述的基因工程菌转化有含编码MBP标签的基因和编码MNR2蛋白的基因的重组质粒表达载体；所述的纯化工艺采用两步纯化，第一步为MBP亲和纯化，第二步为capto Q ImpRes柱与capto adhere柱串联纯化，强阴离子柱即capto Q ImpRes柱在上，强阴离子复合柱即capto adhere柱在下，或者强阴离子柱即capto Q ImpRes柱在前，强阴离子复合柱即capto adhere柱在后。2.根据权利要求1所述的MNR2蛋白纯化工艺，其特征在于，所述的MNR2蛋白纯化工艺，具体包括以下步骤：1）将表达目标蛋白MNR2的大肠杆菌基因工程菌进行发酵与诱导表达，再将发酵诱导后的大肠杆菌菌液离心获得菌泥；2）将步骤1）的菌泥溶解于缓冲液，破碎处理得破碎料液，离心收集上清液，将上清液过滤，得到含有目标蛋白MNR2的滤液；3）MBP亲和层析后得到一步纯化后样品；4）样品稀释：用低盐buffer将步骤3）的MBP亲和层析洗脱后的样品稀释2.5倍，即样品体积与低盐buffer体积比为1：1.5；同时配备5%浓度高低盐buffer，即5份高盐buffer与95份低盐buffer混合均匀，待用；5）层析柱串联：串联连接capto Q ImpRes层析柱与capto adhere 层析柱，强阴离子柱即capto Q ImpRes柱在上，强阴离子复合柱即capto adhere柱在下，或者强阴离子柱即capto Q ImpRes柱在前，强阴离子复合柱即capto adhere柱在后，连接到纯化仪柱位阀上；6）洗柱与平衡：根据不同规格层析柱，流速调节2.0
‑
10mL/min；用5
‑
10倍柱体积的超纯水洗柱，再用3
‑
5倍柱体积的0.5M氢氧化钠或者2M氯化钠清洗柱子，再用5
‑
10倍柱体积的超纯水洗柱，再用3
‑
5倍柱体积的5%浓度高低盐buffer平衡柱子，UV
280
值稳定后校准为0；7）上样与除杂：将步骤4）的稀释后的样品上样，根据不同规格层析柱，流速调节2.0
‑
10mL/min；上样结束后，用3
‑
5倍柱体积的5%浓度高低盐buffer洗杂；8）蛋白洗脱与收集：先拆除capto Q ImpRes柱，再对capto adhere柱进行蛋白洗脱，洗脱梯度设置为20%
‑
25%高低盐梯度洗脱，洗脱液收集为UV
280
紫外吸收值上升至100
±
50mAu开始收集，随后UV
280
值达到最高，然后降至100
±
50mAu停止收集，此为纯化最终料液。3.根据权利要求2所述的MNR2蛋白纯化工艺，其特征在于，所述步骤2）中，具体步骤如下：取菌泥使用5
‑
10倍体积Lysis buffer进行重悬，然后使用均质机700
‑
800bar进行破碎2
‑
3遍，破碎料液再进行离心25000rpm*30分钟，去除破碎菌渣，收集上清液，过0.22um或者0.45um滤膜除菌。4.根据权利要求3所述的MNR2蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘毅，蔡炯，丁国中，刘明霞，肖凯，宋旭，付玉洁，祁丽丽，张晋，肖阳，
申请(专利权)人：元本珠海横琴生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：