用于治疗或预防B型血友病的重组腺相关病毒载体和方法技术

本发明专利技术涉及表达凝血因子IX的表达构建体和重组腺相关病毒(rAAV)载体，包含所述rAAV载体的病毒颗粒和药物组合物，以及它们用于治疗或预防B型血友病的用途。或预防B型血友病的用途。

【技术实现步骤摘要】
用于治疗或预防B型血友病的重组腺相关病毒载体和方法


[0001]本专利技术涉及基因治疗领域。具体来说本专利技术涉及表达(人)凝血因子IX的表达构建体和重组腺相关病毒(rAAV)，包含所述rAAV的病毒颗粒和组合物，以及它们用于治疗或预防由于人凝血因子IX缺乏导致的凝血功能障引起的B型血友病(简称HB)的出血症状的用途。

技术介绍

[0002]血友病(hemophilia)是一组遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，由基因突变导致活性凝血活酶生成障碍，为X染色体隐性遗传，根据缺乏因子类型分为血友病A(缺乏凝血因子VIII即FVIII)和HB(缺乏凝血因子IX即FIX)。HB的主要临床表现为关节内出血和肌肉内出血，由此产生的永久性关节变形会限制运动能力，严重影响生活质量。
[0003]FIX是一类具有丝氨酸蛋白酶活性的凝血因子，主要由肝脏产生并以无活性的酶原形式分泌入血浆。FIX通过FXIa或FVIIa
·
TF复合物转化为激活的FIX(FIXa)，FIXa能与FVIIIa、磷脂和Ca
2+
一起将FX激活成FXa，启动共同凝血途径，发挥止血作用。
[0004]目前，HB的主流疗法仍旧是静脉注射FIX生物制品。但由于凝血因子半衰期短，患者需要终生接受频繁的注射。这虽可在一定程度上控制病程，但仍有出血风险。由于FIX制品生产工艺复杂，产能较低，而且价格昂贵，造成国内凝血因子供需缺口较大，至今人均用量还不到全球平均水平的1/6。另外，患者在使用凝血因子替代治疗时，会产生针对注射因子的抑制物(抗药物抗体)并发症。对这些产生了抑制物的患者而言，使用凝血因子进行预防性治疗的效果将受到影响。
[0005]与直接注射凝血因子相比，通过病毒载体递送其编码基因的基因疗法能够实现稳定、持久的表达。HB疾病是由单基因突变引起，致病机理明确。FIX的cDNA长度较短，因此便于载体携带。另外也已存在成熟的模型动物，包括大动物(HB犬)和小动物(HB小鼠)模型。因此，HB成为了基因疗法的研究热点。
[0006]多项有关HB基因疗法的研究已经取得了深入进展，其中临床数据也证明了其有效性、持续性与安全性。UniQure的AMT
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061和Spark的SPK
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9001临床数据显示，通过AAV载体递送肝脏可以使受试者体内FIX活性维持水平超过流行病学研究推荐的最低标准(>15％)，目前已随访1～3年以上，活性仍然维持在较高水平，年化出血率和FIX用量及输注频次均显著降低，且在现有临床研究中均未发生严重不良事件，证明通过AAV载体基因疗法治疗可以大大提高中重度HB患者的生活质量。
[0007]UniQure公司的AMT
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061是一种基于腺相关病毒5(AAV5)的针对HB的基因疗法。UniQure公司在WO2019011893A1中提供了筛选可能预先具有抗AAV抗体的患者的方法，也提到AAV5相对于其他血清型在人体内局部中和抗体滴度更低。
[0008]CN111647625A中描述了一种提高凝血因子IX表达水平的方法，包括密码子优化和Kozak序列的替换，然后构建到AAV病毒载体，采用三质粒包装系统转染细胞以进行表达。该申请仅在体外证明了凝血因子IX的成功表达，并未进行任何体内实验。
[0009]本领域仍然需要高效且安全的针对HB的基因疗法。

技术实现思路

[0010]本专利技术的专利技术人通过表达盒、FIX突变体的筛选和目的基因编码序列优化，得到了能够高效稳定表达FIX的AAV载体构建体，其在人肝脏细胞及动物模型中均能介导稳定高效的FIX表达，使外源FIX达到有效治疗剂量，并且不存在安全性风险，由此完成了本专利技术。
[0011]因此，在第一方面，本专利技术提供一种表达构建体，其从5
’
到3
’
包含可操作地连接的如下元件：
[0012](1)转录调控元件，其选自LP1、HLP、TTR、HLP2、enTTR、APOE
‑
hAAT启动子；
[0013](2)内含子，其选自SV40内含子或FIX基因内含子；
[0014](3)基因编码序列，其编码具有R338L突变的凝血因子IX；
[0015](4)聚腺苷酸化序列。
[0016]在优选的实施方案中，所述转录调控元件为如SEQ ID NO:5所示的HLP2启动子或如SEQ ID NO:6所示的enTTR启动子。在更优选的实施方案中，所述转录调控元件为如SEQ ID NO:6所示的enTTR启动子。
[0017]在优选的实施方案中，所述内含子选自SEQ ID NO:8所示的FIX Ti299、SEQ ID NO:9所示的modified SV40 intron、SEQ ID NO:10所示的FIX intronA、SEQ ID NO:11所示的FIX intronAco内含子，更优选SEQ ID NO:11所示的FIX intronAco内含子。
[0018]在优选的实施方案中，所述基因编码序列针对人细胞内的表达进行了密码子优化。
[0019]在一些实施方案中，所述基因编码序列具有如下特征：
[0020](1)与SEQ ID NO:13的FIX野生型序列或SEQ ID NO:12的FIX
PADUA
野生型编码序列相比，序列同一性低于80％；并且
[0021](2)与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:23中任一所示的序列相比，序列同一性高于85％，优选高于90％。
[0022]在进一步的实施方案中，所述基因编码序列具有如下特征：
[0023](1)与SEQ ID NO:13的FIX野生型序列或SEQ ID NO:12的FIX
PADUA
野生型编码序列相比，序列同一性低于80％；
[0024](2)与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:23中任一所示的序列相比，序列同一性高于85％，优选高于90％；
[0025](3)与SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:22所示序列相比，序列同一性低于80％。
[0026]在进一步的或另外的实施方案中，所述基因编码序列具有如SEQ ID NOs:16、17、18、20、21和23中任一项所示的核苷酸序列，或与其具有至少85％同一性，优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性，还更优选至少98％同一性的核苷酸序列。在进一步的或另外的实施方案中，所述基因编码序列具有如SEQ ID NOs:17、20和23中任一项所示的核苷酸序列，或与其具有至少85％同一性，优选至少90％同一性，更优选至少95％同一性，还更优选至少98％同一性的核苷酸序列。在更优选的实施方案中，所述基因编码序列为如SEQ ID NOs:16、17、18、20、21和23中任一项所示的核苷酸序列。在最优选的实施方案中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸构建体，其从5
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到3
’
包含可操作地连接的如下元件：(1)转录调控元件，其选自LP1、HLP、TTR、HLP2、enTTR、APOE
‑
hAAT；(2)内含子，其选自SV40内含子或FIX基因内含子；(3)基因编码序列，其编码具有R338L突变的凝血因子IX；(4)聚腺苷酸化序列，其选自SV40 polyA或bGH polyA。2.权利要求1的核酸构建体，其中所述转录调控元件为如SEQ ID NO:5所示的HLP2启动子或如SEQ ID NO:6所示的enTTR启动子，优选如SEQ ID NO:6所示的enTTR启动子。3.权利要求1或2的核酸构建体，其中所述内含子选自SEQ ID NO:8所示的FIX Ti299、SEQ ID NO:9所示的修饰的SV40内含子(mSV40)、SEQ ID NO:10所示的FIXintronA、SEQ ID NO:11所示的FIXintronAco内含子，优选SEQ ID NO:11所示的FIX intronAco内含子。4.权利要求3的核酸构建体，所述基因编码序列具有如下特征：(1)与SEQ ID NO:13的FIX野生型序列或SEQ ID NO:12的FIX
PADUA
野生型编码序列相比，序列同一性低于80％；并且(2)与SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:23中任一所...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭璐，韩稼葆，李伟，田幸雪，刘宾，朱晰，赵小平，
申请(专利权)人：上海天泽云泰生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：