EHBP1L1基因抑制剂作为人乳腺癌治疗药物的应用制造技术

本发明专利技术提供EHBP1L1基因抑制剂作为人乳腺癌治疗药物的应用，用于治疗人乳腺癌药物的分子靶点选择及EHBP1L1基因作为细胞增殖、转移、侵袭的阻断靶点功能基础。该基因功能明确，适于推广应用。于推广应用。于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
EHBP1L1基因抑制剂作为人乳腺癌治疗药物的应用


[0001]本专利技术涉及人乳腺癌细胞治疗领域，特别涉及EHBP1L1基因抑制剂作为人乳腺癌治疗药物的应用。

技术介绍

[0002]乳腺癌是我国乃至全球最常见的恶性肿瘤之一。随着医学技术的不断进步，近年来乳腺癌患者整体生存和预后有所改善，但肿瘤转移和浸润性生长仍是乳腺癌死亡主要的原因，因此及时阻断肿瘤细胞的浸润和转移是治疗乳腺癌和降低乳腺癌死亡率的重要路径。乳腺癌是一种异质性肿瘤，其发生发展是一个多步骤、多阶段、多因素共同参与的过程。
[0003]EHBP1L1基因是一个位于11号染色体上的(11q13.1)的蛋白质产物基因。目前关于EHBP1L1基因仅有少量的文献报道，其功能研究值得进一步探索。一项关于血压调节中的基因
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年龄交互作用的研究发现，血压与EHBP1L1基因座之间存在明显关联，该基因位点仅在欧洲血统的个体中通过基因
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年龄交互作用研究中被发现，表明该基因村早潜在的种族间异质性。另外，EHBP1L1在肿瘤中研究也有报道，Wei等利用5
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CpG分类器筛选出5个与CpGs相对应的基因，其中EHBP1L1的甲基化程度与基因表达呈显著负相关，这些已有的研究提示EHBP1L1基因可能在调控肿瘤进展中发挥不同的作用，包括肿瘤免疫反应、癌细胞增殖和上皮向间充质转化。
[0004]在抗癌药体外干预乳腺癌细胞时，发现抗癌药物作用于乳腺癌细胞时，细胞中EHBP1L1基因的表达水平明显下调，EHBP1L1基因可作为治疗乳腺癌分子靶点之一。
[0005]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供EHBP1L1基因抑制剂作为人乳腺癌治疗药物的应用。涉及EH结构域结合蛋白1样1(EH domain
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binding protein 1
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like 1,EHBP1L1)基因在乳腺癌细胞中生物学功能的研究领域，是EHBP1L1基因作为用于开发抑制乳腺癌细胞增殖、转移和侵袭等方面的治疗靶点研究的理论依据。
[0007]为达到上述目的，本专利技术的技术方案为：
[0008]EHBP1L1基因抑制剂作为人乳腺癌治疗药物的应用。
[0009]进一步的，干扰目的基因EHBP1L1对人乳腺癌细胞MDA
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MB
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231和T
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47D有抑制其细胞增殖的作用。
[0010]一种针对EHBP1L1基因的RNAi慢病毒载体，其能感染乳腺癌MDA
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MB
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231细胞，使细胞内EHBP1L1基因表达沉默。
[0011]进一步的，所述慢病毒载体构建过程为：
[0012]步骤1、RNA干扰靶点设计
[0013]根据RNA干扰序列设计原则，以EHBP1L1基因为模板，设计多个19
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21nt RNA干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取以下序列作为干扰靶点。
[0014][0015]步骤2、DNA oligo序列合成
[0016]根据已选靶点序列设计shRNA干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。除此之外，在正链3
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端添加TTTTT终止信号,而反链5
’
端添加终止信号互补序列。设计完成后送捷瑞公司合成单链DNA oligo。
[0017][0018]＊CCGG：AgeI酶切位点；AATTC：EcoRI酶切位点；G：EcoRI酶切位点互补序列。
[0019]步骤3、双链DNA oligo制备
[0020]将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液中(终浓度20μM)，90℃水浴15min。自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链。
[0021]步骤4、双链DNA oligo与线性化的载体连接、转化、阳性克隆PCR鉴定。
[0022]进一步的，所述慢病毒载体序列如SEQ ID No.1所示。
[0023]相对于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0024]本专利技术提供了EHBP1L1基因的新应用，干扰目的基因EHBP1L1对人乳腺癌细胞MDA
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MB
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231和T
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47D有抑制其增殖的作用；同时还提供了一种针对EHBP1L1基因的RNAi慢病毒载体，其能感染乳腺癌MDA
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MB
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231细胞，使细胞内EHBP1L1基因表达沉默，从而可以作为人乳腺癌细胞治疗药物。
附图说明
[0025]图1为本专利技术的试验流程图；
[0026]图2为qPCR检测mRNA水平EHBP1L1基因消减效率图，其中a为MDA
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MB
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231细胞，b为T
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47D细胞；
[0027]图3为检测EHBP1L1基因消减对细胞克隆形成能力的影响图，其中，a为MDA
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MB
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231细胞，b为T
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47D细胞；
[0028]图4为FACS检测EHBP1L1基因消减对凋亡的影响图，其中a为MDA
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MB
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231细胞，b为T
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47D细胞；
[0029]图5为MTT检测EHBP1L1基因敲减对MDA
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MB
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231细胞增殖影响图；
[0030]图6为MTT检测EHBP1L1基因消减对T
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47D细胞增殖影响图；
[0031]图7为FACS检测EHBP1L1基因消减对MDA
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MB
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231细胞周期影响图；
[0032]图8为FACS检测EHBP1L1基因消减对T
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47D细胞周期影响图；
[0033]图9为Western Blot检测靶点降低MDA
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MB
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231细胞EHBP1L1基因蛋白水平表达图；
[0034]图10为Western Blot检测靶点降低T
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47D细胞EHBP1L1基因蛋白水平表达图；
[0035]图11为载体构建流程图。
具体实施方式
[0036]下面结合附图和具体实施方式对本专利技术技术方案做进一步详细描述：
[0037]实验例：
[0038]实验流程如图1所示：
[0039]一、实验信息
[0040][0041]二、功能检测实验数据
[0042]前期已针对EHBP1L1基因，构建了目的基因RNA干扰慢病毒载体。实验过程如下。
[0043]1、载体构建流程如图11所示：
[0044]2、RNA干扰靶点设计...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.EHBP1L1基因抑制剂作为人乳腺癌治疗药物的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，干扰目的基因EHBP1L1对人乳腺癌细胞MDA
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MB
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231和T
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47D有抑制其增殖的作用。3.一种针对EHBP1L1基因的RNAi慢病毒载体，其能感染乳腺癌MDA
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MB
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231细胞，使细胞内EHBP1L1基因表达沉默。4.根据权利要求3所述RNAi慢病毒载体，其特征在于：所述RNAi慢病毒载体构建过程为：步骤1、RNA干扰靶点设计根据RNA干扰序列设计原则，以EHBP1L1基因为模板，设计多个19
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21nt RNA干扰靶点序列。经设计软件评估测定后，选取以下序列作为干扰靶点。步骤2、D...

【专利技术属性】
技术研发人员：李萍，谢小兵，张贞，胡燕，苏敏，
申请(专利权)人：湖南中医药大学第一附属医院中医临床研究所，
类型：发明
国别省市：