一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因及其制备方法技术

本发明专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA

【技术实现步骤摘要】
一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA
‑
2基因及其制备方法


[0001]本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA
‑
2基因及其制备方法。

技术介绍

[0002]MHC是集中于某一染色体，编码与免疫应答直接相关的一类细胞膜糖蛋白基因簇，呈高度多态性，是目前已知最丰富的基因系统。MHC分子在调节和启动机体免疫应答中发挥重要作用，如动物的免疫识别、对疾病的抵抗能力、免疫系统的调节等，很大程度上均依赖于MHC基因，其生物学功能与物种的生存息息相关，是免疫学研究最活跃的领域之一。
[0003]猪是用于研究MHC功能的重要动物模型。编码猪MHC的基因，又称为猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)，而关于SLA基因区域的表达调节研究非常少。SLA位于猪第7号染色体短臂着丝粒两端7p1.1位置，大多数SLA基因组区域分布有三个典型的基因簇：SLA I类，II类和III类，且基因组大小共约2Mb，是迄今为止检测到哺乳动物MHC中最短且是唯一已知的跨着丝本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA
‑
2基因的制备方法，其特征是，具体包括以下步骤：步骤S1：引物设计与合成；步骤S2：SLA
‑2‑
HB01、SLA
‑2‑
HB01
‑
Flag和SLA
‑2‑
HB01
‑3×
Flag表达载体的构建；步骤S3：猪SLA
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2真核表达载体的构建与鉴定；步骤S4：无内毒素质粒大量提取；步骤S5：293T细胞培养；步骤S6：慢病毒包装，四种质粒与Opti
‑
MEM I培养基按照以下比例：I培养基按照以下比例：I培养基按照以下比例：I培养基按照以下比例：步骤S7：慢病毒感染sT2细胞及筛选；步骤S8：Western blotting检测目的基因质粒表达。2.如权利要求1所述的一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA
‑
2基因的制备方法，其特征是，步骤S4具体包括：(1)从
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80℃冰箱中取出保存的空载体pCDH
‑
CMV
‑
MCS
‑
EF1
‑
copGFP
‑
T2A
‑
Puro(pCDH)菌种和构建的荷包猪真核表达载体SLA
‑2‑
HB01
‑
pCDH、SLA
‑2‑
HB01
‑
Flag
‑
pCDH、SLA
‑2‑
HB01
‑3×
Flag
‑
pCDH的菌种以及慢病毒包装时所需的psPAX2、pMD2.G两个辅助质粒的菌种，分别用接种环“#”字划线法到Amp
+
抗性的LB固体培养基中，37℃正面放置15
‑
30min，待菌液被培养基完全吸收后倒置培养皿，37℃培养12
‑
16h；待长出单菌落后，分别用10μL的枪头挑取单菌
落接种到5mL Amp
+
LB液体培养基中，标记后放置于摇床中，37℃200rpm震荡培养8h；(2)按照10％的比例将预先培养好的6种菌液分别再次接种到50mL Amp
+
LB液体培养基中,标记后放置于摇床中，37℃200rpm震荡培养16
‑
18h；(3)提取质粒之前，首先进行柱平衡：将CP4吸附柱放入2mL收集管中，加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min弃掉收集管中废液，吸附柱重新装回；(4)取15mL过夜培养的菌液放入15mL离心管中，12000rpm 1min离心后，将菌体沉淀转移到1.5mL EP管中，尽量去除上清液；(5)取500μL含RNaseA的溶液P1加入菌体沉淀中，用枪吹打彻底使菌体悬浮；(6)加入500μL溶液P2，快速温和颠倒离心管8次，使菌体充分裂解形成清亮粘稠溶液，此过程不能超过5min；(7)缓慢加入500μL溶液P4，立即缓慢温和颠倒离心管8次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，室温静置10min，12000rpm离心10min，若上清中还有沉淀，再次离心至无沉淀；(8)过滤柱CS放置在新的收集管中，加入上清液于柱中，12000rpm离心3min，将收集管中的过滤液收集；(9)滤液中加入0.3倍体积的异丙醇，上下混匀颠倒后，转移到先前已平衡的吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的液体；(10)吸附柱CP4中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的液体；(11)吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW，加入无水乙醇，室温静置5min后12000rpm离心1min，弃掉收集管中的液体，此步骤重复两次；(12)将吸附柱CP4放入空收集管中，12000rpm离心2min，目的是除去吸附柱中残留的漂洗液；(13)将吸附柱CP4重新放置在一个灭菌1.5mL EP管中，向吸附膜中间加入60μL去离子水，50℃烘箱中放置2min，12000rpm离心2min将质粒收集到EP管中，取1μL进行浓度测量后，分装保存于
‑
20℃，测定浓度，无蛋白质污染后进行下一步骤。3.如权利要求1所述的一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA
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2基因的制备方法，其特征是，步骤S5具体包括：(1)293T细胞的复苏：
①
提前打开细胞间水浴锅加热到37℃，打开超净工作台灭菌，并把枪头、试管架、移液器、培养瓶一并灭菌；
②
在超净工作台中配置好含有10％FBSDMEM培养基，取9mL完全培养基放入15mL无菌离心管中；
③
从液氮罐中取出293T细胞冻存管，立即放入37℃水浴锅里快速晃动解冻；
④
用酒精棉球擦拭冻存管进行消毒，放置于超净工作台中，用枪吹吸管底使沉淀的细胞悬浮，然后转移到存有9mL完全培养基的离心管中，反复吹打几次以彻底去除DMSO，1000rpm离心5min；
⑤
取1mL完全培养基重悬细胞，然后转移到25cm2细胞培养瓶中，添加3mL完全培养基并轻轻摇匀，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养；(2)293T细胞传代：
①
提前打开细胞间37℃水浴锅，对完全培养基和1
×
PBS进行预热，打开超净工作台灭
菌，并把枪头、试管架、移液器、培养瓶一并灭菌；
②
选择生长状态良好且细胞密度为80％培养瓶中的细胞进行消化传代处理；
③
弃掉原培养基，缓慢加入3
‑
4mL 1
×
PBS洗两遍除去瓶中残留的培养基；
④
取500μL 0.1％胰酶滴加到培养瓶中，让蛋白酶均匀铺满整个细胞容器，37℃消化30s，倒置显微镜下可观察到细胞变圆且透亮，大部分漂浮起来时加入3mL完全培养基终止消化；
⑤
反复吹打细胞贴壁的一侧，使细胞彻底从容器中脱落且分散为单个细胞，放入5mL灭菌离心管中，1000rpm离心5min；
⑥
取1mL完全培养基重悬细胞，取100μL细胞悬液放入25cm2细胞培养瓶中，添加3mL完全培养基并轻轻摇匀，然后放置于37℃，5％CO2培养箱中培养；(3)293T细胞的冻存：
①
提前打开细胞间水浴锅加热到37℃，对完全培养基和1
×
PBS进行预热，打开超净工作台灭菌，并把枪头、试管架、移液器、培养瓶一并灭菌；
②
选择生长状态良好且细胞密度为90％培养瓶中的细胞进行冻存；
③
弃掉原培养基，缓慢加入3
‑
4mL 1
×
PBS洗两遍除去瓶中残留的培养基；
④
取500μL 0.1％胰酶滴加到培养瓶中，让蛋白酶均匀铺满整个细胞容器，37℃消化30s，倒置显微镜下可观察到细胞变圆且透亮，大部分漂浮起来时加入3mL完全培养基终止消化；
⑤
反复吹打细胞贴壁的一侧，使细胞彻底从容器中脱落且分散为单个细胞，放入5mL灭菌离心管中，1000rpm离心5min；
⑥
取1mL无血清细胞冻存液进行细胞重悬，然后放入细胞冻存管中，进行名称、时间标记后立即放入
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80℃，24h后可放置于液氮罐中进行长期保存。4.如权利要求1所述的一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA
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2基因的制备方法，其特征是，步骤S6具体包括：(1)将生长状态较好的293T细胞进行传代，接种1.5
×
106个细胞于60mm细胞培养皿中，培养12
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18h后使细胞密度达到80％左右，每种病毒用一个培养皿，共接种4板细胞；(2)转染开始，用枪吸出每个皿中的培养液，用1
×
PBS洗一遍；(3)吸出PBS，每个皿中加入3mL Opti
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MEM I培养基，放置于37℃CO2培养箱中培养，使细胞处于饥饿状态达到较高的转染率；(4)准备转染样品，将质粒与Opti
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MEM I培养基按照目的质粒：pMD2.G：psPAX2＝4:3:2加入到1.5mL EP管中，轻轻混匀，室温静置5min，具体四种质粒与Opti
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MEM I培养基的配比如下：
(5)提前取出转染试剂Lipofectamine 2000使其恢复室温，取出64μL转染试剂稀释于2mLOpti
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MEM I培养基中，室温静置5min；(6)静置5m...

【专利技术属性】
技术研发人员：高凤山，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：