生产免疫球蛋白G降解酶的工程菌株和工艺制造技术

本发明专利技术提供一种生产酿脓链球菌的免疫球蛋白G降解酶(IdeS)的稳定工程菌株。本发明专利技术还提供免疫球蛋白G降解酶的可溶表达方法、发酵制备工艺和纯化工艺。制备工艺和纯化工艺。

【技术实现步骤摘要】
生产免疫球蛋白G降解酶的工程菌株和工艺


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及用于生产一种半胱氨酸水解酶(免疫球蛋白G降解酶)的工程菌株和生产工艺。

技术介绍

[0002]来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的免疫球蛋白G降解酶(Immunoglobulin G
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degrading enzyme of Spyogenes，IdeS)是一种典型的半胱氨酸水解酶。IdeS蛋白酶最初从血清型为M1的A组链球菌菌株中被分离得到。IdeS蛋白酶具有极高的底物特异性，仅识别IgG铰链区的特定位点(CH1结构域和CH2结构域之间)进行切割，以产生F(ab
’
)2和Fc片段。IdeS蛋白酶能够切割多种动物来源的IgG，其底物特异性、切割位点的专一性使其在抗体药物或Fc融合蛋白药物的结构解析中得到广泛应用。
[0003]近年来，IdeS的酶切特性也得到了开发和利用。例如，基于IdeS能够切割免疫球蛋白的能力，将IdeS作为一种免疫抑制剂应用于人类免疫疾病及器官移植等领域。随着用途的扩展，对于IdeS蛋白酶的高效表达及制备工艺提出了挑战。
[0004]IdeS蛋白酶的制备最初利用了其原始生产菌酿脓链球菌，但表达量受到限制。而后，多数学者选择在基因工程常用宿主大肠杆菌表达系统中表达IdeS蛋白酶。许静等人在“半胱氨酸蛋白酶IdeS的原核表达、纯化及活性鉴定”(中国生物工程杂志，2014，34(10)：8
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14)中，描述了利用双标签(GST及His6)表达系统在大肠杆菌中高效表达可溶性GST
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IdeS
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His6的方法，并进行了纯化制备与分析鉴定。在许静的方法中，每1升菌液可获得纯度大于90％的IdeS蛋白酶25mg，此法的表达水平仍然不高，难以大规模应用。除此之外，分子中所引入的标签使药物的人体应用受到限制，大大增加了免疫原性风险，在生物制药领域的应用通常会受到限制。
[0005]IdeS蛋白酶在不同类型的大肠杆菌菌株中表达量差异较大，且由于该分子特性，导致目标表达定位不稳定。而且在不同菌株中，目标蛋白表达量随着菌种代次增加而具有差异性，甚至出现质粒随代次增加而丢失的情况。因此，为了进行IdeS蛋白酶的大规模生产和应用，首要目标是构建稳定表达目标蛋白酶的菌株，并再此基础上尽可能提高目标表达产量，以满足工艺放大需求。
[0006]另外一个问题是如何解决IdeS蛋白酶作为外源蛋白在原核细胞中表达时易形成包涵体。大肠杆菌表达系统与其他外源表达系统相比，具有重组蛋白产量高、易操作、生长速度快和成本低等特点。通过大肠杆菌表达重组蛋白既高效又经济。然而，大肠杆菌是一种原核生物，外源蛋白在大肠杆菌中表达时往往处于还原性环境的胞质中，不易形成二硫键，会出现外源蛋白无法正确折叠的现象，从而形成不可溶的包涵体。如果大量形成了包涵体，则需要在下游进行包涵体变复性的步骤，使得整个制备过程变得繁琐，增加了成本和不确定性。
[0007]现有的文献报道中描述了一些IdeS制备方法，这些方法通常利用使表达的IdeS带有特定标签并利用标签进行亲和纯化。这些方法一般仅关注目标IdeS的纯度和活性，较少
进行关于宿主杂质残留、与安全性相关的内毒素控制、无菌性等的研究。
[0008]在蛋白生物药的商业化过程中，对于直接注射入人体的蛋白药物而言，通常会选择利用其天然结构且不引入标签，从而降低潜在的免疫原性及对活性的影响。因此，需要开发一种不基于标签的目的蛋白下游纯化方法，并获得理化特性和安全性均合格的产品。
[0009]现在亟需一种能够降低IdeS蛋白酶的包涵体比例的生产菌株配套的发酵、纯化工艺，以提高IdeS蛋白酶在大肠杆菌中的可溶性表达，并适用规模化生产。

技术实现思路

[0010]本专利技术的专利技术人进行了大量探索，以期获得改进的表达免疫球蛋白G降解酶的生产菌株，以及用于生产所述酶的发酵、纯化工艺。
[0011]专利技术人对用于表达的IdeS蛋白酶的编码核苷酸序列进行了密码子优化，并通过大量筛选和多种评价手段(如质粒保有率测试、表达量测试、传代稳定性实验)，确定了用于表达IdeS蛋白酶的载体和大肠杆菌菌株的优化组合。所述组合能在大肠杆菌细胞间质中高效、稳定地表达IdeS蛋白酶，显著优于其他组合。
[0012]专利技术人还优化了对应的发酵、纯化工艺。采用所述工艺后，上述菌株表达的IdeS蛋白酶几乎全部为可溶性蛋白形式(不形成包涵体)，且表达量显著提高。另外，本专利技术的工艺能够实现规模化放大，适用于产业上的大规模生产。
[0013]相应地，本专利技术包括以下内容。
[0014]第一方面，本专利技术提供编码酿脓链球菌的免疫球蛋白G降解酶(IdeS蛋白酶)的核苷酸序列，所述IdeS蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述核苷酸序列包含如SEQ ID NO：2～12中任一种所示的核苷酸序列，或由其组成。所述核苷酸序列是经过密码子优化的IdeS蛋白酶编码序列。
[0015]第二方面，本专利技术提供一种重组表达载体，其包含第一方面的核苷酸序列。
[0016]第三方面，本专利技术提供了一种表达IdeS的工程菌株，所述工程菌株为包含重组表达载体的大肠杆菌，所述重组表达载体为包含第一方面的核苷酸序列的表达载体，
[0017]其中所述大肠杆菌为选自下组的大肠杆菌菌株：HMS174(DE3)、BL21(DE3)和BL21 Star(DE3)；且
[0018]所述表达载体为pET
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9a或pET200/D
‑
TOPO。
[0019]在优选的实施方案中，所述菌株和表达载体的组合选自下列组合之一：
[0020](1)菌株为HMS174(DE3)且表达载体为pET
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9a(pET
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9a
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HMS174(DE3)
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IdeS)；
[0021](2)菌株为BL21(DE3)且表达载体为pET200/D
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TOPO(pET200/D
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BL21(DE3)
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IdeS)，和
[0022](3)菌株为BL21 Star(DE3)且表达载体为pET200/D
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TOPO(pET200/D
‑
BL21 Star(DE3)
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IdeS)。
[0023]在更优选的实施方案中，所述菌株为BL21(DE3)且表达载体为pET200/D
‑
TOPO(pET200/D
‑
TOPO
‑
BL21(DE3)
‑
IdeS)。
[0024]第四方面，本专利技术提供了一种IdeS蛋白酶的生产方法，所述方法包括：
[0025](a)将第三方面的工程菌株接种到培养瓶中进行种子培养，至OD
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种编码IdeS蛋白酶的核苷酸序列，其为如SEQ ID NO：2～12中任一项所示的核苷酸序列，并且所述核苷酸序列编码如SEQ ID NO:1所示的IdeS蛋白酶。2.一种重组表达载体，其包含权利要求1中所述的核苷酸序列。3.一种用于表达IdeS蛋白酶的工程菌株，其为包含重组表达载体的大肠杆菌菌株，所述重组表达载体通过向表达载体中引入IdeS蛋白酶的编码核苷酸序列获得，所述编码核苷酸序列由SEQ ID NO：2～12中任一所示的核苷酸序列组成，其中：(1)所述大肠杆菌菌株为HMS174(DE3)且所述表达载体为pET
‑
9a(pET
‑
9a
‑
HMS174(DE3)
‑
IdeS)；(2)所述大肠杆菌菌株为BL21(DE3)且所述表达载体为pET200/D
‑
TOPO(pET200/D
‑
TOPO
‑
BL21(DE3)
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IdeS)，或(3)所述大肠杆菌菌株为BL21 Star(DE3)且所述表达载体为pET200/D
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TOPO(pET200/D
‑
TOPO
‑
BL21 Star(DE3)
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IdeS)。4.权利要求3所述的工程菌株，其表达的IdeS蛋白酶不含标签，如纯化用标签。5.一种生产IdeS蛋白酶的方法，包括：(a)将权利要求3或4所述的工程菌株接种到培养瓶中进行种子培养，至OD
600
达到1.0～2.1，以获得种子培养物；(b)将步骤(a)获得的种子培养物接种到发酵罐中进行发酵培养；(c)在OD
600
达到40～50时加入诱导剂，以诱导IdeS蛋白酶的表达；(d)收获培养物以获得含有IdeS蛋白酶的样品。6.权利要求5所述的方法，其中步骤(a)中的培养使用的种子培养基为LB培养基或TB培养基；和/或其中所述步骤(b)和(c)中的培养使用发酵培养基进行，所述发酵培养基包含：葡萄糖5
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15g/kg，优选8
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12g/kg；酵母粉5
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10g/kg，优选8
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10g/kg；大豆蛋白胨5
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10g/kg，优选8
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10g/kg；磷酸氢二钠5
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10g/kg，优选8
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...

【专利技术属性】
技术研发人员：王双，杨星宇，刘佳琦，张小利，吕魏魏，赵小平，刘宾，
申请(专利权)人：上海天泽云泰生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：