通过以限定的组织形式靶向整合多个表达盒来产生多价多特异性抗体表达细胞的方法技术

本文尤其报道了一种产生三价双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：培养包含编码所述三价双特异性抗体的脱氧核糖核酸的哺乳动物细胞，并从细胞或培养基中回收所述三价双特异性抗体，其中编码所述三价双特异性抗体的所述脱氧核糖核酸稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中并且在5'至3'方向上包含编码第一重链的第一表达盒、编码第一重链的第二表达盒、编码第一轻链的第三表达盒、编码第一轻链的第四表达盒、编码第二重链的第五表达盒、编码第一轻链或第二重链或第二轻链的第六表达盒和编码第二轻链的第七表达盒，其中所述第一重链从N末端至C末端包含第一重链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域、肽接头、第二重链可变结构域和CL结构域，所述第二重链从N末端至C末端包含第一重链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域，所述第一轻链从N末端至C末端包含第一轻链可变结构域和CH1结构域，且所述第二轻链从N末端至C末端包含第二轻链可变结构域和CL结构域，其中所述第二重链可变结构域和所述第一轻链可变结构域形成第一结合位点，且所述第一重链可变结构域和所述第二轻链可变结构域形成第二结合位点。第二结合位点。第二结合位点。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过以限定的组织形式靶向整合多个表达盒来产生多价多特异性抗体表达细胞的方法
[0001]本专利技术属于细胞系产生和多肽生产领域。更准确地说，本文报道了重组哺乳动物细胞，其已通过双重组酶介导的盒式交换反应获得，导致特异性表达盒序列整合到哺乳动物细胞的基因组中。所述细胞可以在用于产生多价多特异性抗体的方法中使用。

技术介绍

[0002]分泌的和糖基化的多肽(诸如抗体)通常通过在真核细胞中重组表达(稳定表达或瞬时表达)而产生。
[0003]用于产生表达感兴趣的外源性多肽的重组细胞的一种策略涉及随机整合编码感兴趣多肽的核苷酸序列，随后是选择步骤和分离步骤。然而，这种方法具有若干缺点。第一，核苷酸序列照此功能性整合到细胞基因组中不仅是罕见的事件，而且考虑到核苷酸序列整合的随机性，这些罕见事件导致多种基因表达表型和细胞生长表型。此类变化称为“位置效应变化”，至少部分地源于真核细胞基因组中存在的复杂基因调控网络以及用于整合和基因表达的某些基因组基因座的可及性。第二，随机整合策略通常无法提供对整合到细胞基因组中的核苷酸序列拷贝数的控制。事实上，通常采用基因扩增方法来获得高产量细胞。然而，这种基因扩增还可能导致不需要的细胞表型，诸如不稳定的细胞生长和/或产物表达。第三，由于随机整合过程中固有的整合基因座异质性，在转染后筛选数千个细胞以分离那些表现出期望的感兴趣多肽表达水平的重组细胞既耗时又费力。即使在分离出此类细胞后，也不能保证感兴趣多肽的稳定表达，并且可能需要进一步筛选以获得稳定的商业化生产细胞。第四，由通过随机整合获得的细胞产生的多肽表现出高度的序列变异，这可能部分是由于用于选择高水平的多肽表达的选择剂的致突变性。最后，要生产的多肽的复杂性越高，即在细胞内形成感兴趣多肽所需的不同多肽或多肽链的数目越高，控制不同多肽或多肽链彼此的表达比就越重要。需要控制该表达比以使感兴趣多肽能够以高表达产量有效表达、正确组装和成功分泌。
[0004]通过重组酶介导的盒式交换(RMCE)进行的靶向整合是将外来DNA特异性和有效地引导至真核宿主基因组中的预定位点的方法(Turan等人，J.Mol.Biol.407(2011)193
‑
221)。
[0005]WO 2006/007850公开了抗恒河猴D重组多克隆抗体，以及使用位点特异性整合到单独的宿主细胞的基因组中的制造方法。
[0006]Crawford,Y.等人(Biotechnol.Prog.29(2013)1307
‑
1315)报道了使用phiC31整合酶和CRE
‑
Lox技术的组合从有限基因组筛选中快速识别用于靶细胞系发育的可靠宿主。
[0007]WO 2013/006142公开了几乎同质的遗传改变的真核细胞群，其基因组中稳定掺入了供体盒，该供体盒包含可操作地连接至分离的核酸片段的强多聚腺苷酸化位点，该分离的核酸片段包含靶向核酸位点和选择标志物蛋白质编码序列，其中该分离的核酸片段侧接第一重组位点和不同的第二重组位点。
[0008]WO 2018/162517公开了依赖于i)表达盒序列和ii)不同表达载体之间表达盒的分
布，观察到表达产量和产物质量的高度变化。
[0009]Tadauchi,T.,等人公开了利用受调控的靶向整合细胞系构建方法来系统地研究是什么使得抗体难以表达(Biotechnol.Prog.35(2019)No.2,1
‑
11)。
[0010]WO 2016/079076公开了针对FolR1和CD3的T细胞活化双特异性抗原结合分子。在实例29中，描述了使用瞬时转染产生双特异性FolR1/CD3
‑
κ
‑
λ抗体，并且三种表达载体的质粒比为1:1:1。在实例36中，描述了通过共转染HEK293
‑
EBNA细胞来制备DP47 GS TCB，相应的表达载体为1:2:1:1的比例(“载体重链Fc(臼)”:“载体轻链”:“载体轻链CrossFab”:“载体重链Fc(杵)
‑
FabCrossFab”)。
[0011]WO 2014/033074公开了一种血脑屏障穿梭。在实例2中，公开了在转染时使用等摩尔质粒比的三种表达质粒瞬时产生三价MAb31
‑
scFab(8D3)。
[0012]据称WO 2017/184831公开了真核细胞中重组蛋白质的位点特异性整合和表达，特别是通过利用表达增强基因座来改进表达真核细胞、特别是中国仓鼠(灰仓鼠)细胞系中的抗体，包括双特异性抗体的方法。本文件中的数据以匿名方式呈现，因此无法得出实际做了什么的结论。当使用Cre重组酶时，它被共转染到另一质粒上，但关于该质粒的组成或来源尚未进行描述。
[0013]Rajendra,Y.等人公开了单个四元载体是用于产生稳定CHO细胞系的一种简单而有效的替代方法，并且可以促进用于临床的异源mAb治疗的细胞系生成(Biotechnol.Prog.33(2017)469
‑
477)。
[0014]Gurumurthy,C.B.和Kent Lloyd,K.C.公开了用于生物医学研究的小鼠模型(Dis.Mod.Mech.12(2019))。他们讨论了通过胚胎干细胞中同源重组的常规基因靶向，如何让位于使得在受精卵中能够等位基因特异性操纵的更精细的方法。
[0015]Bahr,S.等人公开了使用靶向整合在中国仓鼠卵巢细胞中的平台表达系统的构建(细胞培养工程论文集XVI,2018)。
[0016]WO 2017/060144公开了对共刺激TNF受体具有四价的双特异性抗体。WO 2019/086497公开了使用靶向Ox40激动剂的联合疗法。

技术实现思路

[0017]三价双特异性抗体：
[0018]本文报道了一种表达三价双特异性抗体、尤其是二价单特异性抗体的重组哺乳动物细胞，该抗体在其重链之一的一个C末端处包含额外的scFv或Fab片段。三价双特异性抗体是由所述哺乳动物细胞非天然表达的异源多聚体多肽。更具体地说，三价双特异性抗体是包含四种多肽的异源多聚体蛋白质：一条轻链，其为全长轻链；另一条轻链，其为结构域交换轻链；一条重链，其为全长重链；以及另一条重链，其为在它的C末端包含额外的结构域交换重链或轻链Fab片段的延伸的重链。为了实现三价双特异性抗体的表达，已将在特异性和限定的序列中包含多个不同表达盒的重组核酸整合到哺乳动物细胞的基因组中。
[0019]尤其是，根据本专利技术的方法可用于产生脑穿梭抗体。这些脑穿梭抗体可以具有例如在WO 2014/033074中所描述的形式。这些分子可以同时与血脑屏障细胞上的人转铁蛋白受体(第一特异性)及与靶治疗抗原(第二特异性)结合，从而诱导转运及治疗效果。
[0020]本文还报道了一种用于产生表达三价双特异性抗体的重组哺乳动物细胞的方法，
以及一种使用所述重组哺乳动物细胞产生三价双特异性抗体的方法。
[0021]在一个优本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于产生三价双特异性抗体的方法，其包括以下步骤：a)培养包含编码所述三价双特异性抗体的脱氧核糖核酸的哺乳动物细胞，以及b)从细胞或培养基中回收所述三价双特异性抗体，其中编码所述三价双特异性抗体的所述脱氧核糖核酸稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中，并且在5'至3'方向上包含
‑
编码第一重链的第一表达盒，
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编码第一重链的第二表达盒，
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编码第一轻链的第三表达盒，
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编码第一轻链的第四表达盒，
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编码第二重链的第五表达盒，
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编码第一轻链或第二重链或第二轻链的第六表达盒，和
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编码第二轻链的第七表达盒。2.一种编码三价双特异性抗体的脱氧核糖核酸，其在5'至3'方向上包含
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编码第一重链的第一表达盒，
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编码第一重链的第二表达盒，
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编码第一轻链的第三表达盒，
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编码第一轻链的第四表达盒，
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编码第二重链的第五表达盒，
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编码第一轻链或第二重链或第二轻链的第六表达盒，和
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编码第二轻链的第七表达盒。3.脱氧核糖核酸用于在哺乳动物细胞中表达三价双特异性抗体的用途，所述脱氧核糖核酸在5'至3'方向上包含
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编码第一重链的第一表达盒，
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编码第一重链的第二表达盒，
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编码第一轻链的第三表达盒，
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编码第一轻链的第四表达盒，
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编码第二重链的第五表达盒，
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编码第一轻链或第二重链或第二轻链的第六表达盒，和
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编码第二轻链的第七表达盒。4.一种重组哺乳动物细胞，其包含编码整合在所述细胞的基因组中的三价双特异性抗体的脱氧核糖核酸，其中编码所述三价双特异性抗体的所述脱氧核糖核酸在5'至3'方向上包含
‑
编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第一重链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，
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编码第一轻链的第四表达盒，
‑
编码第二重链的第五表达盒，
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编码第一轻链或第二重链或第二轻链的第六表达盒，和
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编码第二轻链的第七表达盒。
5.一种包含两种脱氧核糖核酸的组合物，所述两种脱氧核糖核酸进而包含三种不同的重组识别序列和四个表达盒，其中
‑
所述第一脱氧核糖核酸在5'至3'方向上包含
‑
第一重组识别序列，
‑
编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第一重链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，
‑
编码第一轻链的第四表达盒，和
‑
第三重组识别序列的第一拷贝，并且
‑
所述第二脱氧核糖核酸在5'至3'方向上包含
‑
第三重组识别序列的第二拷贝，
‑
编码第二重链的第五表达盒，
‑
编码第一轻链或第二重链或第二轻链的第六表达盒，
‑
编码第二轻链的第七表达盒，和
‑
第二重组识别序列。6.一种用于产生包含编码三价双特异性抗体的脱氧核糖核酸并分泌所述三价双特异性抗体的重组哺乳动物细胞的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含整合在所述哺乳动物细胞的基因组的基因座内的单个位点处的外源核苷酸序列，其中所述外源核苷酸序列包含侧接至少一个第一选择标志物的第一重组识别序列和第二重组识别序列，以及位于所述第一重组识别序列与所述第二重组识别序列之间的第三重组识别序列，并且所有的所述重组识别序列都不同；b)向a)中所提供的细胞中引入两种脱氧核糖核酸的组合物，所述两种脱氧核糖核酸包含三种不同的重组识别序列和至少七个表达盒，其中
‑
所述第一脱氧核糖核酸在5'至3'方向上包含
‑
第一重组识别序列，
‑
编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第一重链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，
‑
编码第一轻链的第四表达盒，和
‑
第三重组识别序列的第一拷贝，并且
‑
所述第二脱氧核糖核酸在5'至3'方向上包含
‑
第三重组识别序列的第二拷贝，
‑
编码第二重链的第五表达盒，
‑
编码第一轻链或第二重链或第二轻链的第六表达盒，
‑
编码第二轻链的第七表达盒，和
‑
第二重组识别序列，其中所述第一脱氧核糖核酸和所述第二脱氧核糖核酸的所述第一重组识别序列至所
述第三重组识别序列与整合的外源核苷酸序列上的所述第一重组识别序列至所述第三重组识别序列匹配，其中编码一个第二选择标志物的表达盒的5'末端部分和3'末端部分在合在一起时形成所述一个第二选择标志物的功能性表达盒；c)i)与b)的所述第一脱氧核糖核酸和所述第二脱氧核糖核酸同时引入，或者ii)在其后依次引入一种或多种重组酶，其中所述一种或多种重组酶识别所述第一脱氧核糖核酸和所述第二脱氧核糖核酸的所述重组识别序列；(并且任选地其中所述一种或多种重组酶进行两次重组酶介导的盒交换；)以及d)选择表达所述第二选择标志物并且分泌所述三价双特异性抗体的细胞，从而产生包含编码所述三价双特异性抗体的脱氧核糖核酸并分泌所述三价双特异性抗体的重组哺乳动物细胞。7.根据权利要求1至6中任一项所述的用于产生三价双特异性抗体的方法、或脱氧核糖核酸、或用途、或重组哺乳动物细胞、或组合物、或用于产生重组哺乳动物细胞的方法，其中所述脱氧核糖核酸在所述七个表达盒后包含编码第二轻链的第八表达盒。8.根据权利要求1至7中任一项所述的用于产生三价双特异性抗体的方法、或脱氧核糖核酸、或用途、或重组哺乳动物细胞、或组合物、或用于产生重组哺乳动物细胞的方法，其中所述第一重链在CH3结构域中包含突变T366W(根据Kabat编号)，并且所述第二重链在CH3结构域中包含突变T366S、L368A和Y407V(根据Kabat编号)。9.根据权利要求8所述的用于产生三价双特异性抗体的方法、或脱氧核糖核酸、或用途、或重组哺乳动物细胞、或组合物、或用于产生重组哺乳动物细胞的方法，其中所述重链中的一条进一步包含突变S354C并且相应的另一条重链包含突变Y349C(根据Kabat编号)。10.根据权利要求1至9中任一项所述的用于产生三价双特异性抗体的方法、或脱氧核糖核酸、或用途、或重组哺乳动物细胞、或组合物、或用于产生重组哺乳动物细胞的方法，其中所述第一重链为包含额外的结构域交换Fab片段VH
‑
VL或CH1
‑
CL的延伸重链。11.根据权利要求1至10中任一项所述的用于产生三价双特异性抗体的方法、或脱氧核糖核酸、或用途、或重组哺乳动物细胞、或组合物、或用于产生重组哺乳动物细胞的方法，其中所述第一轻链为结构域交换轻链VH
‑
VL或CH1
‑
CL。12.根据权利要求1至11中任一项所述的用于产生三价双特异性抗体的方法、或脱氧核糖核酸、或用途、或重组哺乳动物细胞、或组合物、或用于产生重组哺乳动物细胞的方法，其中
‑
所述第一重链从N末端到C末端包含第一重链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域、肽接头、第二重链可变结构域和CL结构域，
‑
所述第二重链从N末端到C末端包含第一重链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域，
‑
所述第一轻链从N末端到C末端包含第一轻链可变结构域和CH1结构域，并且
‑
所述第二轻链从N末端到C末端包含第二轻链可变结构域和CL结构域，其中所述第二重链可变结构域和所述第一轻链可变结构域形成第一结合位点，并且所述第一重链可变结构域和所述第二轻链可变结构域形成第二结合位点。13.根据权利要求1、3、4和权利要求6至12中任一项所述的用于产生三价双特异性抗体的方法、或脱氧核糖核酸、或用途、或重组哺乳动物细胞、或组合物、或用于产生重组哺乳动物细胞的方法，其中所述脱氧核糖核酸的恰好一个拷贝在单个位点或基因座处稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中。14.根据权利要求1至5和7至13中任一项所述的用于产生三价双特异性抗体的方法、或脱氧核糖核酸、或用途、或重组哺乳动物细胞、或组合物、或用于产生重组哺乳动物细胞的方法，其中编码所述三价双特异性抗体的所述脱氧核糖核酸包含另外的编码选择标志物的表达盒，其中编码所述选择标志物的所述表达盒部分位于所述第三重组识别序列的5'并且部分位于所述第三重组识别序列的3'，其中所述表达盒的位于5'的部分包含启动子和起始密码子，并且所述表达盒的位于3'的部分包含没有起始密码子的编码序列和多聚A信号，其中所述起始密码子与所述编码序列可操作连接，其中编码所述选择标志物的所述表达盒的位于5'的部分包含可操作地连接至起始密码子的启动子序列，由此所述启动子序列在上游侧接所述第四表达盒，并且所述起始密码子在下游侧接所述第三重组识别序列；并且编码所述选择标志物的所述表达盒的位于3'的部分包含编码缺少起始密码子的所述选择标志物的核酸，且在上游侧接所述第三重组识别序列和在下游侧接所述第五表达盒，其中所述起始密码子与所述编码序列可操作连接。15.根据权利要求1至14中任一项所述的用于产生三价双特异性抗体的方法、或脱氧核糖核酸、或用途、或重组哺乳动物细胞、或组合物、或用于产生重组哺乳动物细胞的方法，其中用于抗体链的各表达盒在5'至3'方向上包含启动子、编码抗体链的核酸和多聚腺苷酸化信号序列，以及任选地终止子序列，并且编码所述选择标志物的各表达盒在5'至3'方向上包含启动子、编码所述选择标志物的核酸和多聚腺苷酸化信号序列，以及任选地终止子序列，其中对于除所述选择标志物的所述表达盒之外，所述启动子为具有内含子A的人CMV启动子，所述多聚腺苷酸化信号序列为bGH多聚腺苷酸化信号序列，并且所述终止子为hGT终止子，其中对于所述选择标志物的所述表达盒，所述启动子为SV40启动子，并且所述多聚腺苷酸化信号序列为SV40多聚腺苷酸化信号序列，并且不存在终止子。16.根据权利要求1、3、4和权利要求6至15中任一项所述的用于产生三价双特异性抗体的方法、或脱氧核糖核酸、或用途、或重组哺乳动物细胞、或组合物、或用于产生重组哺乳动物细胞的方法，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。17.根据权利要求1至16中任一项所述的用于产生三价双特异性抗体的方法、或脱氧核糖核酸、或用途、或重组哺乳动物细胞、或组合物、或用于产生重组哺乳动物细胞的方法，其中所有盒均单向排布。
18.一种用于产生三价抗体的方法，其包括以下步骤：a)培养包含编码所述三价抗体的脱氧核糖核酸的哺乳动物细胞，以及b)从细胞或培养基中回收所述三价抗体，其中编码所述三价抗体的所述脱氧核糖核酸稳定地整合到所述哺乳动物细胞的基因组中并且在5'至3'方向上包含(1)
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编码第一重链的第一表达盒，
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编码第一轻链的第二表达盒，
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编码第一轻链的第三表达盒，
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编码第二重链的第四表达盒，和
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编码第二轻链的第五表达盒，或(2)
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编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第一轻链的第二表达盒，
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编码第一轻链的第三表达盒，
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编码第二重链的第四表达盒，
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编码第二轻链的第五表达盒，
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编码第二轻链的第六表达盒，或(3)
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编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第二重链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，
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编码第二轻链的第四表达盒，
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编码第二轻链的第五表达盒，或(4)
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编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第二重链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，
‑
编码第二轻链的第四表达盒，
‑
编码第一重链的第五表达盒，
‑
编码第二轻链的第六表达盒，或(5)
‑
编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第二重链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，
‑
编码第二轻链的第四表达盒，
‑
编码第二重链的第五表达盒，
‑
编码第二轻链的第六表达盒，
‑
编码第二轻链的第七表达盒，
或(6)
‑
编码第一轻链的第一表达盒，
‑
编码第一轻链的第二表达盒，
‑
编码第一重链的第三表达盒，
‑
编码第二重链的第四表达盒，
‑
编码第二轻链的第五表达盒，
‑
编码第二轻链的第六表达盒。19.一种编码三价抗体的脱氧核糖核酸，其在5'至3'方向上包含(1)
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编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第一轻链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，
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编码第二重链的第四表达盒，和
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编码第二轻链的第五表达盒，或(2)
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编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第一轻链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，
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编码第二重链的第四表达盒，
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编码第二轻链的第五表达盒，
‑
编码第二轻链的第六表达盒，或(3)
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编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第二重链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，
‑
编码第二轻链的第四表达盒，
‑
编码第二轻链的第五表达盒，或(4)
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编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第二重链的第二表达盒，
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编码第一轻链的第三表达盒，
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编码第二轻链的第四表达盒，
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编码第一重链的第五表达盒，
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编码第二轻链的第六表达盒，或(5)
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编码第一重链的第一表达盒，
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编码第二重链的第二表达盒，
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编码第一轻链的第三表达盒，
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编码第二轻链的第四表达盒，
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编码第二重链的第五表达盒，
‑
编码第二轻链的第六表达盒，
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编码第二轻链的第七表达盒，或(6)
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编码第一轻链的第一表达盒，
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编码第一轻链的第二表达盒，
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编码第一重链的第三表达盒，
‑
编码第二重链的第四表达盒，
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编码第二轻链的第五表达盒，
‑
编码第二轻链的第六表达盒。20.脱氧核糖核酸用于在哺乳动物细胞中表达三价抗体的用途，所述脱氧核糖核酸在5'至3'方向上包含(1)
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编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第一轻链的第二表达盒，
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编码第一轻链的第三表达盒，
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编码第二重链的第四表达盒，和
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编码第二轻链的第五表达盒，或(2)
‑
编码第一重链的第一表达盒，
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编码第一轻链的第二表达盒，
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编码第一轻链的第三表达盒，
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编码第二重链的第四表达盒，
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编码第二轻链的第五表达盒，
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编码第二轻链的第六表达盒，或(3)
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编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第二重链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，
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编码第二轻链的第四表达盒，
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编码第二轻链的第五表达盒，或(4)
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编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第二重链的第二表达盒，
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编码第一轻链的第三表达盒，
‑
编码第二轻链的第四表达盒，
‑
编码第一重链的第五表达盒，
‑
编码第二轻链的第六表达盒，或(5)
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编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第二重链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，
‑
编码第二轻链的第四表达盒，
‑
编码第二重链的第五表达盒，
‑
编码第二轻链的第六表达盒，
‑
编码第二轻链的第七表达盒，或(6)
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编码第一轻链的第一表达盒，
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编码第一轻链的第二表达盒，
‑
编码第一重链的第三表达盒，
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编码第二重链的第四表达盒，
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编码第二轻链的第五表达盒，
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编码第二轻链的第六表达盒。21.一种重组哺乳动物细胞，其包含整合在细胞的基因组中的编码三价抗体的脱氧核糖核酸，其中所述编码三价抗体的脱氧核糖核酸在5'至3'方向上包含(1)
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编码第一重链的第一表达盒，
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编码第一轻链的第二表达盒，
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编码第一轻链的第三表达盒，
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编码第二重链的第四表达盒，和
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编码第二轻链的第五表达盒，或(2)
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编码第一重链的第一表达盒，
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编码第一轻链的第二表达盒，
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编码第一轻链的第三表达盒，
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编码第二重链的第四表达盒，
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编码第二轻链的第五表达盒，
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编码第二轻链的第六表达盒，或(3)
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编码第一重链的第一表达盒，
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编码第二重链的第二表达盒，
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编码第一轻链的第三表达盒，
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编码第二轻链的第四表达盒，
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编码第二轻链的第五表达盒，或(4)
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编码第一重链的第一表达盒，
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编码第二重链的第二表达盒，
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编码第一轻链的第三表达盒，
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编码第二轻链的第四表达盒，
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编码第一重链的第五表达盒，
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编码第二轻链的第六表达盒，或(5)
‑
编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第二重链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，
‑
编码第二轻链的第四表达盒，
‑
编码第二重链的第五表达盒，
‑
编码第二轻链的第六表达盒，
‑
编码第二轻链的第七表达盒，或(6)
‑
编码第一轻链的第一表达盒，
‑
编码第一轻链的第二表达盒，
‑
编码第一重链的第三表达盒，
‑
编码第二重链的第四表达盒，
‑
编码第二轻链的第五表达盒，
‑
编码第二轻链的第六表达盒。22.一种包含两种脱氧核糖核酸的组合物，所述两种脱氧核糖核酸进而包含三种不同的重组识别序列和五至七个表达盒，其中
‑
所述第一脱氧核糖核酸在5'至3'方向上包含(1)
‑
第一重组识别序列，
‑
编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第一轻链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，和
‑
第三重组识别序列的第一拷贝，或(2)
‑
第一重组识别序列，
‑
编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第一轻链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，和
‑
第三重组识别序列的第一拷贝，或(3)
‑
第一重组识别序列，
‑
编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第二重链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，
‑
编码第二轻链的第四表达盒，和
‑
第三重组识别序列的第一拷贝，或(4)
‑
第一重组识别序列，
‑
编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第二重链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，
‑
编码第二轻链的第四表达盒，和
‑
第三重组识别序列的第一拷贝，或(5)
‑
第一重组识别序列，
‑
编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第二重链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，
‑
编码第二轻链的第四表达盒，和
‑
第三重组识别序列的第一拷贝，或(6)
‑
第一重组识别序列，
‑
编码第一轻链的第一表达盒，
‑
编码第一轻链的第二表达盒，
‑
编码第一重链的第三表达盒，和
‑
第三重组识别序列的第一拷贝，并且
‑
所述第二脱氧核糖核酸在5'至3'方向上包含(1)
‑
第三重组识别序列的第二拷贝，
‑
编码第二重链的第四表达盒，
‑
编码第二轻链的第五表达盒，和
‑
第二重组识别序列，或(2)
‑
第三重组识别序列的第二拷贝，
‑
编码第二重链的第四表达盒，
‑
编码第二轻链的第五表达盒，
‑
编码第二轻链的第六表达盒，和
‑
第二重组识别序列，或(3)
‑
第三重组识别序列的第二拷贝，
‑
编码第二轻链的第五表达盒，和
‑
第二重组识别序列，或(4)
‑
第三重组识别序列的第二拷贝，
‑
编码第一重链的第五表达盒，
‑
编码第二轻链的第六表达盒，和
‑
第二重组识别序列，或(5)
‑
第三重组识别序列的第二拷贝，
‑
编码第二重链的第五表达盒，
‑
编码第二轻链的第六表达盒，
‑
编码第二轻链的第七表达盒，和
‑
第二重组识别序列，或(6)
‑
第三重组识别序列的第二拷贝，
‑
编码第二重链的第四表达盒，
‑
编码第二轻链的第五表达盒，
‑
编码第二轻链的第六表达盒，和
‑
第二重组识别序列。23.一种用于产生包含编码三价抗体的脱氧核糖核酸并且分泌所述三价抗体的重组哺乳动物细胞的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含整合在所述哺乳动物细胞的基因组的基因座内的单个位点处的外源核苷酸序列，其中所述外源核苷酸序列包含侧接至少一个第一选择标志物的第一重组识别序列和第二重组识别序列，以及位于所述第一重组识别序列与所述第二重组识别序列之间的第三重组识别序列，并且所有的所述重组识别序列都不同；b)向a)中所提供的细胞中引入两种脱氧核糖核酸的组合物，所述两种脱氧核糖核酸包含三种不同的重组识别序列和五至七个表达盒，其中
‑
所述第一脱氧核糖核酸在5'至3'方向上包含(1)
‑
第一重组识别序列，
‑
编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第一轻链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，和
‑
第三重组识别序列的第一拷贝，或(2)
‑
第一重组识别序列，
‑
编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第一轻链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，和
‑
第三重组识别序列的第一拷贝，或(3)
‑
第一重组识别序列，
‑
编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第二重链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，
‑
编码第二轻链的第四表达盒，和
‑
第三重组识别序列的第一拷贝，或(4)
‑
第一重组识别序列，
‑
编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第二重链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，
‑
编码第二轻链的第四表达盒，和
‑
第三重组识别序列的第一拷贝，或(5)
‑
第一重组识别序列，
‑
编码第一重链的第一表达盒，
‑
编码第二重链的第二表达盒，
‑
编码第一轻链的第三表达盒，
‑
编码第二轻链的第四表达盒，和
‑
第三重组识别序列的第一拷贝，或(6)
‑
第一重组识别序列，
‑
编码第一轻链的第一表达盒，
‑
编码第一轻链的第二表达盒，
‑
编码第一重链的第三表达盒，和
‑
第三重组识别序列的第一拷贝，并且
‑
所述第二脱氧核糖核酸在5'至3'方向上包含(1)
‑
第三重组识别序列的第二拷贝，
‑
编码第二重链的第四表达盒，
‑
编码第二轻链的第五表达盒，和
‑
第二重组识别序列，或(2)
‑
第三重组识别序列的第二拷贝，
‑
编码第二重链的第四表达盒，
‑
编码第二轻链的第五表达盒，
‑
编码第二轻链的第六表达盒，和
‑
第二重组识别序列，或(3)
‑
第三重组识别序列的第二拷贝，
‑
编码第二轻链的第五表达盒，和
‑
第二重组识别序列，或(4)
‑
第三重组识别序列的第二拷贝，
‑
编码第一重链的第五表达盒，
‑
编码第二轻链的第六表达盒，和
‑
第二重组识别序列，或(5)
‑
第三重组识别序列的第二拷贝，
‑
编码第二重链的第五表达盒，
‑
编码第二轻链的第六表达盒，
‑
编码第二轻链的第七表达盒，和
‑
第二重组识别序列，或(6)
‑
第三重组识别序列的第二拷贝，
‑
编码第二重链的第四表达盒，
‑
编码第二轻链的第五表达盒，
‑
编码第二轻链的第六表达盒，和
‑
第二重组识别序列，其中所述第一脱氧核糖核酸和所述第二脱氧核糖核酸的所述第一重组识别序列至所述第三重组识别序列与整合的外源核苷酸序列上的所述第一重组识别序列至所述第三重组识别序列匹配，其中编码一个第二选择标志物的表达盒的5'末端部分和3'末端部分在合在一起时形成所述一个第二选择标志物的功能性表达盒；c)i)与b)的所述第一脱氧核糖核酸和所述第二脱氧核糖核酸同时引入，或者ii)在其后依次引入一种或多种重组酶，其中所述一种或多种重组酶识别所述第一脱氧核糖核酸和所述第二脱氧核糖核酸的所述重组识别序列；(并且任选地其中所述一种或多种重组酶进行两次重组酶介导的盒交换；)以及d)选择表达所述第二选择标志物并且分泌所述三价抗体的细胞，从而产生包含编码所述三价抗体的脱氧核糖核酸并且分泌所述三价抗体的重组哺乳动物细胞。24.根据权利要求18至23中任一项所述的用于产生三价抗体的方法、或脱氧核糖核酸、或用途、或重组哺乳动物细胞、或组合物、或用于产生重组哺乳动物细胞的方法，其中所述
第一重链在CH3结构域中包含突变T366W(根据Kabat编号)，并且所述第二重链在CH3结构域中包含突变T366S、L368A和Y407V(根据Kabat编号)，或反之亦然。25.根据权利要求24所述的用于产生三价抗体的方法、或脱氧核糖核酸、或用途、或重组哺乳动物细胞、或组合物、或用于产生重组哺乳动物细胞的方法，其中所述重链中的一条进一步包含突变S354C并且相应的另一条重链包含突变Y349C(根据Kabat编号)。26.根据权利要求18至25中任一项所述的用于产生三价抗体的方法、或脱氧核糖核酸、或用途、或重组哺乳动物细胞、或组合物、或用于产生重组哺乳动物细胞的方法，其中所述第一重链是包含额外的结构域交换Fab片段的延伸重链。27.根据权利要求18至26中任一项所述的用于产生三价抗体的方法、或脱氧核糖核酸、或用途、或重组哺乳动物细胞、或组合物、或用于产生重组哺乳动物细胞的方法，其中所述第一轻链为结构域交换轻链VH
‑
VL或CH1
‑
CL。28.根据权利要求18至27中任一项所述的用于产生三价抗体的方法、或脱氧核糖核酸、或用途、或重组哺乳动物细胞、或组合物、或用于产生重组哺乳动物细胞的方法，其中
‑
所述第一重链从N末端到C末端包含第一重链可变结构域、CH1结构域、第一轻链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域，
‑
所述第二重链从N末端到C末端包含第一重链可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域，
‑
所述第一轻链从N末端到C末端包含第二重链可变结构域和CL结构域，并且
‑
所述第二轻链从N末端到C末端包含第二轻链可变结构域和CL结构域，其中所述第一重链可变结构域和所述第二轻链可变结构域形成第一结合位点，并且所述第二重链可变结构域和所述第一轻链可变结构域形成第二结合位点。29.根据权利要求18、20、21和权利要求23至28中任一项所述的用于产生三价抗体的方法、或脱氧核糖核酸、或用途、或重组哺乳动物细胞、或组合物、或用于产生重组哺乳动物细胞的方法，其中所述脱氧核糖核酸在单个位点或基因座稳定整合到所述哺乳动物细胞的基因组中。30.根据权利要求18至22和权利要求24至29中任一项所述的用于产生三价抗体的方法、或脱氧核糖核酸、或用途、或重组哺乳动物细胞、或组合物、或用于产生重组哺乳动物细胞的方法，其中编码所述三价抗体的所述脱氧核糖核酸包含另外的编码选择标志物的表达盒，其中所述编码选择标志物的表达盒部分位于所述第三重组识别序列的5'并且部分位于所述第三重组识别序列的3'，其中所述表达盒的位于5'的部分包含启动子和起始密码子，并且所述表达盒的位于3'的部分包含没有起始密码子的编码序列和多聚A信号，其中所述起始密码子与所述编码序列可操作连接。31.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：豪夫迈，
类型：发明
国别省市：