【技术实现步骤摘要】
基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法
[0001]本专利技术涉及生物
,具体涉及一种基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法。
技术介绍
[0002]慢病毒常用于嵌合抗原受体
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T细胞治疗(Chimeric Antigen Receptor T
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Cell Immunotherapy,CAR
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T),其具有转导效率高、可整合T细胞基因组并持续表达目标蛋白等优势。现如今,CAR
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T生产大多基于慢病毒载体介导的CAR基因转移。当前,用于生产慢病毒的工艺大多基于依赖胎牛血清(FBS)的贴壁细胞工艺(如HEK293T),其具有慢病毒表达滴度高、硬件投入少等优点。然而,其依赖胎牛血清(FBS),这与当前的法规不相适宜,因此必须对FBS的生产厂商进行严格审计,此外还需对去除进行评估和检测。其次,胎牛血清(FBS)批次及产地差异也可能导致所表达的慢病毒存在批间差异。另一个关键问题是,目前使用贴壁细胞工艺多数为细胞 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法,其特征在于:包括以下步骤:S1、适合慢病毒包装的HEK293T贴壁细胞的克隆筛选,其具体包括以下步骤:A1、复苏贴壁培养的HEK293T细胞,使用DEME培养基+10%FBS进行贴壁培养;A2、将对数生长期的细胞以VP
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SFM培养基+2mMGLutaMax+10%FBS完全培养基进行贴壁培养;A3、将对数生长期的细胞进行96孔细胞培养板铺板,每孔补加VP
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SFM培养基+2mMGLutaMax+10%FBS完全培养基;A4、培养5~7天后进行克隆观察,并更换一部分的VP
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SFM培养基+2mMGLutaMax+10%FBS完全培养基,继续培养,待细胞克隆扩大至所需的量时使用胰酶进行消化,将一部分细胞作为种子细胞,另一部分细胞进行携带EGFP基因的慢病毒转移质粒和包装质粒共转染,并进行细胞克隆标记;筛选出侵染效率较高的前若干个克隆细胞,进行扩大培养并建库,扩大培养时使用的培养基为VP
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SFM+1%FBS培养基;S2、对筛选的HEK293T贴壁细胞进行快速悬浮驯化,具体包括以下步骤:B1、使用VP
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SFM+2 mM GlutaMax+1%FBS培养基复苏冻存的EGFP慢病毒包装滴度高的克隆细胞,静置培养2~3天后消耗细胞;然后仅以VP
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SFM+2 mM GlutaMax进行扩大静置培养,继续静置培养2~3天后收集细胞;用VP
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SFM +1%FBS完全培养基培养至状态良好后,使用不含FBS的VP
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SFM培养基进行扩大培养,收集扩大培养的细胞进行活细胞密度计数;B2、使用Transpro CD01+4 mM GlutaMax+0.1% Anti
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clumping agent完全培养基于细胞培养摇瓶进行振荡培养,复悬细胞后使用细胞培养摇床进行振荡培养,然后进行适应性传代培养,直至细胞活率为93~98%,且细胞分散性较好、无明显聚集,此即为悬浮驯化成功的HEK293T细胞,将若干悬浮驯化好的克隆细胞扩大培养并进行冻存;S3、悬浮HEK293T高滴度慢病毒包装克隆细胞的筛选,具体步骤为:使用Transpro CD01+4 mM GlutaMax+0.1% Anti
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clumping agent完全培养基复苏冻存的HEK293T悬浮细胞克隆,使用EGFP慢病毒转移质粒和包装质粒共转染各悬浮HEK293T细胞克隆,48 h后收获各细胞克隆含EGFP慢病毒的上清液,1500 g离心15 min去除细胞及其碎片,然后以此上清进行不同倍数稀释,并将稀释的病毒液侵染96孔板贴壁的HEK293T细胞,以荧光显微镜和流式细胞术(FACS)检测并筛选侵染效率高的病毒上清,所对应的克隆细胞即为慢病毒高产的悬浮HEK293T细胞克隆。2.根据权利要求1所述的基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法,其特征在于:步骤A3中,采用有限稀释法按5
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20 cells/mL进行96孔细胞培养板铺板,每孔添加50
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100 μL稀释的细胞液,然后每孔补加50
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100μL的VP
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SFM培养基+2mMGLutaMax+10%FBS完全培养基。3.根据权利要求1所述的基于HEK293T克隆筛选的用于高滴度慢病毒生产的悬浮驯化方法,其特征在于:步骤A4中,待细胞克隆扩大至96孔底的2/3时使用胰酶进行消化,将一部分细胞在新的96孔培养板继续培养作为种子细胞,另一部分细胞于另一个新的96孔板进行携带EGFP基...
【专利技术属性】
技术研发人员:胡迪超,马红,隋礼丽,孔令洁,
申请(专利权)人:苏州博腾生物制药有限公司,
类型:发明
国别省市:
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