一种用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，其包括如下步骤：PCR扩增目标基因片段、目的基因包装到载体中、转染、慢病毒分离和检测、测定HA蛋白表达情况、测定血清杀伤活性。本发明专利技术有着如下有益效果：本发明专利技术构建的细胞株高效均一地表达HA蛋白，在普通二级实验室即可操作，为测定H7N9血清杀伤效应提供稳定、可靠的靶细胞来源；本发明专利技术提供的细胞系带有ZSgreen荧光报告基因，无需额外的标记，且能区分靶细胞与效应细胞；本发明专利技术建立的检测H7N9禽流感免疫血清Fc效应的方法，为全面认识H7N9疫苗的免疫保护机理提供有力工具；除了针对特定的病菌外，本发明专利技术还可以对其他家禽疫苗抗体Fc免疫效应的测定提供了技术参考。供了技术参考。供了技术参考。

【技术实现步骤摘要】
一种用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法


[0001]本专利技术涉及生物技术
，特别是涉及一种用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法。

技术介绍

[0002]H7N9亚型禽流感是2013年新发的人兽共患传染病，给家禽养殖与公共卫生安全带来了重大威胁。目前，研究者已经研制了众多的H7N9亚型禽流感候选疫苗株。除了传统的血清学指标，包括血凝抑制(HI)与病毒中和(VN)抗体外，抗体介导的Fc免疫效应对于疫苗保护力也具有重要贡献。
[0003]IgG抗体的Fab区负责识别并结合抗原，主要负责介导HI与VN活性。IgG Fc区结合免疫效应细胞表面的Fc受体，激活抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)及抗体依赖的补体介导的杀伤作用(ADCML)免疫杀伤效应，诱导对病原的杀伤作用。但是，对于流感疫苗，尤其是禽流感疫苗，仍缺少特异、准确、标准的免疫效应检测方法。
[0004]抗体免疫杀伤效应的检测方法主要包括靶细胞、效应细胞与待测抗体三个组分。其中，靶细胞是影响检测方法灵敏度与特异性的关键因素。对于流感疫苗而言，现有的大多数检测技术使用流感病毒感染的细胞作为靶细胞。但是，这种方法存在以下缺陷：1)病毒感染的剂量与时间等实验参数难以标准化；2)对于H5、H7亚型等高致病性禽流感病毒，需要在生物安全三级实验室进行感染，限制了大多数低级别实验室从事相关研究；3)病毒感染细胞造成的细胞死亡，与抗体杀伤造成的细胞死亡混淆，导致实验噪音过高，特异性降低；4)荧光染料标记靶细胞的效果不均一；2)死亡的靶细胞及操作过程中死亡的效应细胞均会干扰对靶细胞杀伤水平的测定。因此，开发新的靶细胞对于建立高效的抗体Fc效应测定方法具有重要意义。
[0005]为了解决流感疫苗抗体Fc免疫效应测定的靶细胞来源问题，本专利技术利用慢病毒包装技术，构建了一株稳定表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因的293T细胞，同时表达ZSgreen荧光报告基因。该细胞系一方面保证细胞中靶抗原的均一、稳定表达，另一方面以ZSgreen的表达区分靶细胞与效应细胞，提高检测特异性。

技术实现思路

[0006]本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和专利技术名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和专利技术名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本专利技术的范围。
[0007]鉴于上述和/或现有中存在的问题，提出了本专利技术。
[0008]因此，本专利技术其中一个目的是，克服现有用于测定H7N9亚型禽流感病毒杀伤效应测定的靶细胞的鉴定能力的不足，提供一种用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细
胞及鉴定方法。
[0009]为解决上述技术问题，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了如下技术方案：一种用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：
[0010]PCR扩增目标基因片段：使用PCR技术对于目的基因进行扩增；
[0011]目的基因包装到载体中：将目标基因包装到载体中；
[0012]转染：将质粒和细胞混合，然后加入转染试剂，混合物滴加到293T细胞培养液中，培养；
[0013]慢病毒分离和检测：将转染中得到的含病毒颗粒的培养基过滤、离心、弃上清、重悬，然后进行慢病毒质量检测；
[0014]测定HA蛋白表达情况：将目的细胞接种待其贴壁后，进行空细胞致死最低浓度筛选，空白组对照检测慢病毒感染后的细胞存活比例和药物抗性；
[0015]测定血清杀伤活性：将慢病毒转导的细胞与鸡免疫效应细胞混合，设置空白对照组测定疫苗免疫鸡血清的杀伤效应。
[0016]作为本专利技术所述对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法的一种优选方案，其中：PCR扩增目标片段中，所述PCR扩增目标毒株为GD15，目标基因为HA基因。
[0017]作为本专利技术所述对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法的一种优选方案，其中：目的基因包装到载体中，使用的技术手段为无缝克隆。
[0018]作为本专利技术所述对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法的一种优选方案，其中：目的基因包装到载体中，使用HA基因上下游加入的同源臂。
[0019]作为本专利技术所述对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法的一种优选方案，其中：目的基因包装到载体中，使用的内切酶为Xba I与Not I。
[0020]作为本专利技术所述对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法的一种优选方案，其中：转染中，使用的载体包括装载有目标基因的载体、pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体。
[0021]作为本专利技术所述对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法的一种优选方案，其中：转染中，使用的细胞为293T细胞。
[0022]作为本专利技术所述对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法的一种优选方案，其中：慢病毒分离和检测中包括物理检测、无菌检测、病毒滴度测定。
[0023]作为本专利技术所述对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法的一种优选方案，其中：目的基因包装到载体中，使用的载体为FV115。
[0024]作为本专利技术所述对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法的一种优选方案，其中：测定HA蛋白表达情况中，过滤的滤膜孔径为0.22μm，离心转速为80000g，离心4h，弃去上清后重悬，重悬液需在经过0.22微米过滤除菌。
[0025]本专利技术提供了一种对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，属于生物
，具体涉及一种基于人胚胎肾细胞系(293T)构建的稳定表达H7N9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)的细胞，可作为测定H7N9亚型禽流感疫苗阳性血清杀伤效应的靶细胞。
[0026]本专利技术利用慢病毒包装技术构建一株同时稳定表达H7N9 HA蛋白与ZSgreen荧光
报告基因的293T细胞系(293T
‑
HA)，中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC No.C2021132；本专利技术还提供一种以293T
‑
HA细胞为靶细胞的鸡H7N9免疫血清杀伤效应的测定方法。该细胞系能够高水平、稳定表达H7N9 HA蛋白，且表达ZSgreen绿色荧光蛋白作为报告基因，能够作为靶细胞用于检测H7N9亚型AIV阳性血清的特异性杀伤活性，在评价H7N9亚型禽流感抗体介导的免疫效应方面具有潜在的应用价值。
[0027]本专利技术有着如下有益效果：
[0028](1)现有技术使用禽流感病毒感染细胞制备靶细胞，缺点在于背景噪声高、表达效率低、均一性差，且需要高级别生物安全实验条件；本专利技术构建的细胞株高效均一地表达HA蛋白，在普通二级实验室即可操本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：PCR扩增目标基因片段：使用PCR技术对于目的基因进行扩增；目的基因包装到载体中：将目标基因包装到载体中；转染：将质粒和细胞混合，然后加入转染试剂，混合物滴加到293T细胞培养液中，培养；慢病毒分离和检测：将转染中得到的含慢病毒颗粒的培养基过滤、离心、弃上清、重悬，然后进行慢病毒质量检测；测定HA蛋白表达情况：将目的细胞接种待其贴壁后，进行空细胞致死最低浓度筛选，空白组对照检测慢病毒感染后的细胞存活比例和药物抗性；测定血清杀伤活性：将慢病毒转导的细胞、免疫血清与鸡免疫效应细胞混合，设置空白对照组测定疫苗免疫鸡血清的杀伤效应。2.根据权利要求1中所述的用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增目标基因片段中，所述PCR扩增目标毒株为GD15，目标基因为HA基因。3.根据权利要求1中所述的用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，其特征在于：所述目的基因包装到载体中，使用的技术手段为无缝克隆。4.根据权利要求1或3中所述的用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，其特征在于：所述目的基因包装到载体中，使用...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡增垒，刘秀梵，张艳焱，胡娇，黄雅，石磊，何晓政，邓婧，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：