一种用于敲除猪免疫球蛋白重链IGHG区的gRNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于敲除猪免疫球蛋白重链IGHG区的gRNA及其应用。本发明专利技术所要保护的一个技术方案是敲除猪免疫球蛋白重链IGHG区的方法，所述方法包括向猪细胞中导入降低或抑制猪免疫球蛋白重链恒定区的IGHG区的蛋白质活性或含量的物质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质。本发明专利技术利用猪免疫球蛋白重链IGHG区重复序列多的特点，通过使用序列表中序列2所示的4个gRNA联用核酸分子的CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种用于敲除猪免疫球蛋白重链IGHG区的gRNA及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种用于敲除猪免疫球蛋白重链IGHG区的gRNA及其应用。

技术介绍

[0002]治疗性抗体在治疗及预防各类病原体感染方面具有重大的意义。然而，传统抗体的研发需要抗体筛选、亲和力成熟、人源化、生产制备等环节，耗时漫长，特别是对于一些新型病原体或突变型病原体的感染治疗，很难起到快速应对的效果。
[0003]抗体药物在治疗及预防各类病原体感染方面均具有重大的意义时间就是生命，如何在最短的时间内研发并生产出足量的抗体药物是这类药物研发的关键。传统抗体的研发需要抗体筛选、亲和力成熟、人源化、生产制备等环节，耗时漫长，特别是对于一些新型病原体或突变型病原体的感染治疗，很难起到快速应对的效果。使用马血清用于治疗病原体引发的感染，很早就有应用，主要的风险就是马血清生产的抗体可能有很强的免疫原性，在一定程度上限制了其广泛应用。将人免疫球蛋白基因引入其他动物的基因组，并在这些动物中表达各种人的抗体是近几年研究人源化抗体的热点。转基因动物内源性的免疫球蛋白发生系统在被置换成人源性的发生系统后，识别抗原和动员抗体产生的系统依然保持完整。由于抗体是体内产生的，经历了正常装配和成熟过程，所合成的抗体与人体自身合成的非常近似，从而保证了成品具有较高的靶亲和力。截止2017年底，美国FDA(美国食品和药物管理局)批准了25个全人抗体药物上市，其中18个来源于人抗体转基因动物，年产值逾千亿美金，这反映出全人源抗体药物是未来抗体发展的趋势和生物制药的制高点，而人源化抗体动物成为生产全人源抗体药物的战略资源性动物。
[0004]为了获得全人源抗体，利用人的IgG替换小鼠IgG，世界上已成功培育出XenoMouse，VelocImmune，Harbour mouse，kymab和OmniRat等为数不多的人源化抗体小鼠和大鼠，并用于全人源抗体药物的生产。尽管利用转基因小鼠生产全人源化抗体已经成为目前抗体医药领域的主流，但是由于小鼠太小，无法从血液中直接获取抗体。猪和牛等大动物不受限于体积，可以直接实现抗体的“牧场式”生产。Robt和他的同事已经阐明了人类的Ig基因座也可以被正确的重排并在牛中表达。日本Kyowa Hakko Kirin公司培育出免疫球蛋白全人源转基因牛，但由于其采用的技术存在一定的缺陷，难以稳定遗传，需要进一步完善。Therapeutic Human Polyclonals Inc(THP)、Ablynx、Origen Therapeutics、Revivicor等公司目前也在利用兔、骆驼、鸡和猪开展人源化抗体转基因动物的研究，但尚在进行之中。
[0005]猪在进化上比小鼠和牛更接近于人类，将具有与人更相近的功能。仔猪模型具有优于啮齿动物模型的优点，因为胎儿抗体库的发展没有母体的影响，此外，猪模型相对牛来说，有更多的优势：(1)孕期以及发情时间较短，(2)幼崽数量多，(3)已经建立了饲养无特异性病原体猪和无菌猪的特定方法。转基因猪在农业和生物医药方面都有着广泛的应用。将外源基因敲入猪体细胞的基因组中，一直都是极为困难的，因为传统的同源重组(HR)效率
极低。锌指核酸酶技术、TALEN技术以及CRISPR/Cas9技术开创了全新的基因组编辑时代，解决了传统基因打靶技术难度大、编辑效率低和成本高等缺点。CRISPR/Cas9技术于2013年开始被应用于基因编辑研究，构建使用更为便捷，效率更高，因其基因打靶效率更高，可以一次性实现多个基因编辑研究，成本更低而得到广泛的应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是如何敲除猪免疫球蛋白重链恒定区IGHG区的基因组序列。
[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了敲除猪免疫球蛋白重链的方法。所述方法包括向猪细胞中导入降低或抑制猪免疫球蛋白重链恒定区的IGHG区的蛋白质活性或含量的物质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质。
[0008]上文所述降低或抑制猪免疫球蛋白重链恒定区的IGHG区的蛋白质活性或含量的物质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质可为如下c1)
‑
c4)任一种物质：
[0009]c1)抑制或降低猪免疫球蛋白重链恒定区的IGHG区的蛋白质活性或含量的物质或调控所述蛋白质编码基因表达的核酸分子。所述核酸分子可为表达靶向所述猪免疫球蛋白重链恒定区的IGHG区的蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或靶向所述猪免疫球蛋白重链恒定区的IGHG区的蛋白编码基因的gRNA。
[0010]c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒。
[0011]c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体。
[0012]c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物。
[0013]上文c1)所述核酸分子可为如下b1)或b2)所示的DNA分子：
[0014]b1)、序列表中序列2所示的DNA分子。
[0015]b2)、与b1)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性的DNA分子。
[0016]上述方法中，术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、98％或99％的同一性。
[0017]上文所述gRNA可包括4个不同的gRNA：gRNA1、gRNA2、gRNA3和gRNA4。所述gRNA1的编码DNA序列可为序列表序列2的第271
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290位核苷酸所示。所述gRNA2的编码DNA序列可为序列表序列2的第629
‑
648位核苷酸所示。所述gRNA3的编码DNA序列可为序列表序列2的第987
‑
1006位核苷酸所示。所述gRNA4的编码DNA序列可如序列表序列2的第1345
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1364位核苷酸所示。
[0018]上文所述gRNA1靶向于猪基因组的靶位点位置可为B1，所述gRNA2靶向于猪基因组的靶位点位置可为B2，所述gRNA3和gRNA4靶向于猪基因组的靶位点位置可为B3和B4。
[0019]所述B1靶位点序列可对应于序列表中序列1的第2082
‑
2101位、第23121
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23140位、第44503
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44522位、第66711
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66730位、第91639
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91658位、第110035
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110054位核苷酸。所述B2靶位点序列可对应于序列表中序列1的第2207
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2226位、第23246
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23265位、第44628
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.敲除猪免疫球蛋白重链的方法，其特征在于：所述方法包括向猪细胞中导入降低或抑制猪免疫球蛋白重链恒定区的IGHG区的蛋白质活性或含量的物质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质；所述降低或抑制猪免疫球蛋白重链恒定区的IGHG区的蛋白质活性或含量的物质或调控所述蛋白质编码基因表达的物质为如下c1)
‑
c4)任一种物质：c1)抑制或降低猪免疫球蛋白重链恒定区的IGHG区的蛋白质活性或含量的物质或调控所述蛋白质编码基因表达的核酸分子；所述核酸分子为表达靶向所述猪免疫球蛋白重链恒定区的IGHG区的蛋白编码基因的gRNA的DNA分子或靶向所述猪免疫球蛋白重链恒定区的IGHG区的蛋白编码基因的gRNA；c2)含有c1)所述核酸分子的表达盒；c3)含有c1)所述核酸分子的重组载体、或含有c2)所述表达盒的重组载体；c4)含有c1)所述核酸分子的重组微生物、或含有c2)所述表达盒的重组微生物、或含有c3)所述重组载体的重组微生物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：c1)所述核酸分子为如下b1)或b2)所示的DNA分子：b1)、序列表中序列2所示的DNA分子；b2)、与b1)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性的DNA分子。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述猪免疫球蛋白重链恒定区的IGHG区的核苷酸序列如序列表中序列1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：林艳丽，王友亮，吴晓洁，邢鹏程，崔雨萌，李响，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：