一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方法及其应用，本发明专利技术探讨的主要问题为K562细胞能否同时稳定表达IL

【技术实现步骤摘要】
一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及NK细胞扩增
，具体为一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方 法及其应用。

技术介绍

[0002]癌症仍然是严重威胁人类健康的头号杀手，从全球范围来看，癌症的发病率逐年升高。 目前，癌症的传统疗法不能取得良好的效果，而不能满足患者已经患者家属对恢复健康的期 待。癌症的免疫治疗，是目前医学界公认的最有前景的肿瘤治疗方法。自然杀伤细胞(naturalkiller cell，NK)是机体重要的固有免疫细胞，与T细胞或者其他免疫细胞相比，它能迅速释 放炎症性细胞因子在无需预先刺激的情况下，无组织相容性复合体(major histocompatibilitycomplex，MHC)限制性的杀伤肿瘤细胞。NK细胞用于肿瘤免疫治疗，它的来源非常广泛， 如外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMC)、脐带血(cordblood，CB)、 骨髓(born marrow，BM)、胚胎干细胞(embryonic stem cell，MSC)或诱导多能干细胞 (inducedpluripotent stem cell，ips)等。
[0003]早期的研究表明，通过细胞因子注射在体内扩增NK细胞并不能为肿瘤患者带来任何治 疗效果。近年来，一系列的文献报道以及临床研究显示通过体外活化、扩增NK细胞，再通 过静脉回输显示出良好的抗肿瘤应用前景。NK细胞在外周血单个核细胞中只占5
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20％，在 其他组织和器官中的分布水平也不及外周血。NK细胞在体外扩增后回输体内之后寿命有限， 且不能增殖。然而，细胞治疗通常需要制备大量的细胞，NK细胞回输到体内的数量直接决 定了治疗效果。因此，如何在体外高效扩增NK细胞数量以及增强NK细胞的肿瘤杀伤能力 是NK细胞用于肿瘤免疫治疗的关键。
[0004]目前，已经开发出多种方法体外扩增足够数量和纯度的NK细胞。例如，通过IL
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2、IL
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15、 IL
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18和IL
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21等细胞因子对NK细胞进行刺激扩增。然而这种方法首先是摸索多种细胞因子 的浓度、添加时间等条件。这种方法费时费力不说，而且成本高昂、扩增效率一般、纯度也 不敢保证。还有一种常用的方法是通过滋养细胞刺激NK细胞活化、扩增。目前在国外临床 试验中最常用的滋养细胞是经过辐照的K562基因工程细胞同时表达膜结合IL
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21和4
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1BBL (又称Clone 9细胞)，这种基因修饰细胞表达细胞因子和共刺激分子配体的方式既有效， 又能很好的控制生产成本。然而，这种方法获得的NK细胞扩增效率依旧不如人意，还有很 大的提升空间，也存在不同个体来源的PBMC之间的扩增倍数重复性差等缺点。因此，急需 一种高效的扩增高纯度NK细胞的方式。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方法及其应用，以解决 上述
技术介绍
中提出的问题。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方法，包括以下步骤：
[0008](1)pLV
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mbIL
‑
21
‑
OX40L
‑
CD48慢病毒载体质粒的构建；
[0009](2)采用pLV
‑
mbIL
‑
21
‑
OX40L
‑
CD48慢病毒载体质粒制备重组慢病毒；
[0010](3)提取重组慢病毒，感染k562细胞，分选后进行亚克隆，灭菌后得到K562
‑
ZHX滋 养细胞。
[0011]较优化的方案，步骤(1)具体为：
[0012]S1：获取人IL
‑
21、人OX40L、人CD48的基因编码序列；
[0013]S2：将人IL
‑
21基因编码序列、PGK启动子编码序列、人OX40L基因编码序列、T2A 自我剪切肽编码序列、CD48基因编码序列依次串联，得mbIL
‑
21
‑
PGK
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OX40L
‑
T2A
‑
CD48 基因序列；其中mbIL
‑
21
‑
PGK
‑
OX40L
‑
T2A
‑
CD48基因序列如SEQ ID NO.6所示；
[0014]S3：将mbIL
‑
21
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PGK
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OX40L
‑
T2A
‑
CD48基因序列构建至质粒载体pLV
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EF1a
‑
IRES
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Puro (Addgene公司购买)的BamH I和Xma I之间，得到pLV
‑
mbIL
‑
21
‑
OX40L
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CD48慢病毒载 体质粒。
[0015]较优化的方案，步骤S1中，人IL
‑
21的基因编码序列如SEQ ID NO.1所示，人OX40L 的基因编码序列如SEQ ID NO.2所示，人CD48的基因编码序列如SEQ ID NO.3所示。PGK 启动子编码序列的基因编码序列如SEQ ID NO.4所示；T2A自我剪切肽编码序列的基因编码 序列如SEQ ID NO.5所示。
[0016]较优化的方案，步骤S3具体为：
[0017]S31：将mbIL
‑
21
‑
PGK
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OX40L
‑
T2A
‑
CD48基因序列进行BamH I、Xmal I双酶切，并电 泳回收；
[0018]S32：将慢病毒转移质粒pLV
‑
EF1a
‑
IRES
‑
Puro进行BamH I、Xmal I双酶切，并电泳回收 线性化骨架质粒；
[0019]S33：将酶切后的mbIL
‑
21
‑
PGK
‑
OX40L
‑
T2A
‑
CD48基因通过Ligation High Ver2连接酶 连接到酶切后的pLV
‑
EF1a
‑
IRES
‑
Puro骨架质粒上，其转化到感受态E.coli(DH5α)细胞上，纯 化，制得pLV
‑
mbIL
‑
21
‑
OX40L
‑
CD48慢病毒载体质粒。
[0020]较优本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)pLV
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mbIL
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21
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OX40L
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CD48慢病毒载体质粒的构建；(2)采用pLV
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mbIL
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21
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OX40L
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CD48慢病毒载体质粒制备重组慢病毒；(3)提取重组慢病毒，感染k562细胞，分选后进行亚克隆，灭菌后得到K562
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ZHX滋养细胞。2.根据权利要求1所述的一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方法，其特征在于：步骤(1)具体为：S1：获取人IL
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21、人OX40L、人CD48的基因编码序列；S2：将人IL
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21基因编码序列、PGK启动子编码序列、人OX40L基因编码序列、T2A自我剪切肽编码序列、CD48基因编码序列依次串联，得mbIL
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21
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PGK
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OX40L
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T2A
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CD48基因序列；其中mbIL
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21
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PGK
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OX40L
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T2A
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CD48基因序列如SEQ ID NO.6所示；S3：将mbIL
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21
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PGK
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OX40L
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T2A
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CD48基因序列构建至质粒载体中，得到pLV
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mbIL
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21
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OX40L
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CD48慢病毒载体质粒。3.根据权利要求2所述的一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方法，其特征在于：步骤S1中，人IL
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21的基因编码序列如SEQ ID NO.1所示，人OX40L的基因编码序列如SEQ ID NO.2所示，人CD48的基因编码序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求2所述的一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方法，其特征在于：步骤S3具体为：S31：将mbIL
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21
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PGK
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OX40L
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T2A
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CD48基因序列进行BamH I、Xmal I双酶切，并电泳回收；S32：将慢病毒转移质粒pLV
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EF1a
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IRES
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Puro进行BamH I、Xmal I双酶切，并电泳回收线性化骨架质粒；S33：将酶切后的mbIL
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21
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PGK
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OX40L
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T2A
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CD48基因通过Ligation High Ver2连接酶连接到酶切后的pLV
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EF1a
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IRES
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Puro骨架质粒上，其转化到感受态E.coli(DH5α)细胞上，纯化，制得pLV
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mbIL
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21
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OX40L
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CD48慢病毒载体质粒。5.根据权利要求1所述的一种利用基因工程修饰的滋养细胞的制备方法，其特征在于：步骤(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏玉龙，吴金芸，叶华衍，
申请(专利权)人：中海峡福建细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：