低强度超声促进体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了低强度超声促进体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，包括以下步骤：把Oct4、Sox2、Klf4、c

【技术实现步骤摘要】
低强度超声促进体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法


[0001]本专利技术涉及超声医学和再生医学
，尤其是涉及一种诱导性多能干细胞的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]通过将四种转录因子Oct4，Sox2，Klf4和c
‑
Myc基因(又称山中因子)转导到已分化的体细胞中，诱导体细胞退分化重新编程为具有多能干细胞性质的细胞群体，这类细胞被命名为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)。2006年日本科学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)对24个转录因子进行筛选，最终确定了四因子的重编程方法，先后在小鼠和人的成纤维细胞中诱导出iPSCs，为世人瞩目。随后世界多个生物研究室都相继完成iPSCs的诱导，并证实了iPSCs具有与胚胎干细胞极为相似的属性，能够进行自我更新和分化为三胚层，在疾病模型构建、药物筛选和干细胞疗法等研究中具有广阔的应用前景，是再生医学的重要里程碑。
[0003]理论上全身细胞都可以被重编程为iPSCs，且由于细胞是自体来源，可以免受伦理和免疫排斥的限制。然而，iPSCs的转染成功率低、培养周期长、制备成本高成为其在临床上推广和应用的瓶颈。例如，在一个培养周期中，仅约0.5％的小鼠胚胎成纤维细胞(约12天)和约0.0002％的人真皮成纤维细胞(约25天)能够被成功诱导出iPSCs。近十几年来，许多研究通过改变生物载体(使用不同的病毒株)或添加化合物小分子来提高iPSCs的诱导效率，被证实具有提升重编程的效果，然而其培养成本也随之上涨。超声仪是一种常见的仪器，其发射振动频率在20kHz以上的机械波，在临床上不仅用于人体组织或血流成像，还可用于促骨折愈合、加速软组织再生和抑制炎症等理化治疗作用，具有低成本、无电离辐射且适用范围广泛等优势。此外，低强度脉冲超声可用于介导血脑屏障开放、促进成骨细胞再生和神经源细胞分化，在调节细胞功能及代谢方面具有特殊效果。据报道，在iPSCs培养的早期，细胞的能量代谢和供能方式发生剧烈变化，这些变化由于细胞的线粒体息息相关。有文献报道，线粒体渗透性转换孔(mPTP)开放的细胞具有更高效的形成iPSCs的能力。mPTP开放介导PHF8蛋白降低H3K9me2/H3K27me3的甲基化水平，促进iPSCs的产生。而超声亦有调节mPTP的能力，低强度超声结合微泡产生的空化效应，能够促使细胞mPTP开放，这为超声调节细胞代谢或促进细胞重编程奠定基础。此外，超声还具有重塑染色质的作用，其为染色质的多位点开放和多基因表达提供了条件。最后，超声空化效应会改变细胞内ROS水平，后者在重编程或者及维持iPSC形态中有着重要作用。总而言之，超声作为一种临床上常用的诊断及治疗技术，在再生医学领域尤其是介导细胞重编程、提高iPSCs产生效率方面有特殊效用。
[0004]本专利技术充分利用自主搭建的超声辐照平台的优势结合细胞重编程实验，利用无辐射、安全、经济的超声促进体细胞重编程，提高iPSCs细胞的获取效率，开发一种新型的高效细胞重编程辅助技术。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术体细胞重编程为iPSCs细胞效率不高的问题，本专利技术提出低强度超声促进体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术利用超声相关生物学效应，在体细胞重编程早期进行刺激作用，促进诱导性多能干细胞的产生。提供了一种低强度超声促进体细胞重编程生成诱导性多能干细胞的方法，包括以下步骤：
[0007](1)转染，使用慢病毒载体把Oct4、Sox2、Klf4、c
‑
Myc转染体细胞；
[0008](2)转染后48h，采用超声辐照连续处理1
‑
5天，期间每日更换iPSCs培养基，细胞异位过表达四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c
‑
Myc，每日更换iPSCs培养基，培养至细胞形态发生改变出现干细胞克隆体，此后更换为干细胞培养基，得到诱导性多能干细胞。
[0009]进一步地，所述步骤(1)的操作是：提前一天取6孔板培养基，每孔加入1mL 0.1％明胶铺板30min，取2
×
104个体细胞种植到所述6孔板中，每孔加入2mL相应的体细胞培养基，细胞培养箱(37℃，5％CO2)中过夜。
[0010]慢病毒转染当天提前1h更换无血清培养基；取载有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c
‑
Myc的慢病毒(MOI＝20)和5μg/mL聚凝胺混合后加入待转染的所述6孔板中，置于条件为37℃，5％CO2培养箱中继续过夜；次日吸弃旧培养基，每孔加入2mL新鲜的相应的体细胞培养基后继续培养。转染后48h，荧光显微镜下分析细胞转染情况。
[0011]进一步地，按下述公式取载有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c
‑
Myc的慢病毒体积和5μg/mL聚凝胺混合后加入待转染所述6孔板中，
[0012]病毒体积＝(细胞数目
×
MOI)/病毒滴度。
[0013]进一步地，所述体细胞是HDF；
[0014]所述体细胞培养基是HDF培养基；
[0015]所述HDF培养基(500mL)为添加50mL胎牛血清、5mL L
‑
谷氨酰胺、5mL非必需氨基酸、5mL青霉素/链霉素、435mL DMEM培养基。
[0016]进一步地，所述iPSCs培养基(500mL)为添加50mL胎牛血清、5mL L
‑
谷氨酰胺、5mL非必需氨基酸、5mLβ
‑
巯基乙醇(10mM)、1000U/mL白血病抑制因子和405mL Knockout DMEM。
[0017]进一步地，所述干细胞培养基(500mL)为添加50mL血清替代物、5mL L
‑
谷氨酰胺、5mL非必需氨基酸、5mLβ
‑
巯基乙醇(10mM)、1000U/mL白血病抑制因子和405mL Knockout DMEM。
[0018]进一步地，所述步骤(2)超声辐照处理是输出能量为声强0.2～1.4W/cm2、频率1MHz、占空比10％，辐照时间1分钟的脉冲波。
[0019]进一步地，所述步骤(2)超声辐照处理是输出能量为声强0.8W/cm2、频率1MHz、占空比10％，辐照时间1分钟的脉冲波。
[0020]进一步地，所述步骤(2)中采用超声辐照连续处理1
‑
5天，期间每日更换iPSCs培养基；细胞异位过表达四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c
‑
Myc，培养15
‑
20天，期间每日更换iPSCs培养基，至细胞形态发生改变出现干细胞克隆体，此后更换为干细胞培养基，得到诱导性多能干细胞。
[0021]本专利技术还提供所述低强度超声促进体细胞重编程生成诱导性多能干细胞的方法得到的诱导性多能干细胞在制备自体细胞治疗药物中的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.低强度超声促进体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)转染，使用慢病毒载体把Oct4、Sox2、Klf4、c
‑
Myc转染体细胞，；(2)转染后48h，采用超声辐照连续处理1
‑
5天，期间每日更换iPSCs培养基；细胞异位过表达四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c
‑
Myc，每日更换iPSCs培养基，培养至细胞形态发生改变出现干细胞克隆体，此后更换为干细胞培养基，得到诱导性多能干细胞。2.根据权利要求1所述低强度超声促进体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)的操作是：提前一天取6孔板培养基，每孔加入1mL 0.1％明胶铺板30min，取2
×
104个体细胞种植到所述6孔板中，每孔加入2mL相应的体细胞培养基，细胞培养箱37℃，5％CO2中过夜；慢病毒转染当天提前1h更换无血清培养基；取载有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c
‑
Myc的慢病毒，MOI＝20和5μg/mL聚凝胺混合后加入待转染的所述6孔板中，置于条件为37℃，5％CO2培养箱中继续过夜；次日吸弃旧培养基，每孔加入2mL新鲜的相应的体细胞培养基后继续培养，转染后48h，荧光显微镜下分析细胞转染情况。3.根据权利要求2所述低强度超声促进体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，按下述公式取载有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c
‑
Myc的慢病毒体积和5μg/mL聚凝胺混合后加入待转染所述6孔板中，病毒体积＝(细胞数目
×
MOI)/病毒滴度。4.根据权利要求2所述低强度超声促进体细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述体细胞是HDF；所述体细胞培养基是HDF培养基；HDF培养基500mL为添加...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈智毅，杜萌，李悦，
申请(专利权)人：南华大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：