一种表达人CD19抗原的淋巴瘤细胞株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种表达人CD19抗原的淋巴瘤细胞株及其构建方法和应用，属于细胞或动物模型技术领域。一种表达人CD19抗原的淋巴瘤细胞株的构建方法，将人CD19抗原序列插入pWPI载体上，得到的重组pWPI载体与PSPAX2/PMD2C1和转染试剂共同处理真核细胞，得到的包装的病毒感染淋巴瘤细胞，培养得到表达人CD19抗原的淋巴瘤细胞株。所述细胞株接种到Balb/c小鼠体内发现该细胞可以在免疫功能健全的小鼠体内正常成瘤，可用于构建肿瘤免疫小鼠模型，为后续肿瘤药物研究提供了基础。肿瘤药物研究提供了基础。肿瘤药物研究提供了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种表达人CD19抗原的淋巴瘤细胞株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于细胞或动物模型
，具体涉及一种表达人CD19抗原的淋巴瘤细胞株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是一组在基因表型、病理形态以及临床症状上表现各异的高异质性大B细胞增生性疾病。CD19在B细胞分化的所有阶段均有表达，并在B细胞恶性转化过程中持续携带。CD19在超过95％的B细胞恶性肿瘤(例如慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，B细胞NHL和B细胞急性淋巴细胞性白血病(ALL))中表达。尽管CD19在正常的非恶性B细胞上表达，但众所周知，癌症患者在化疗或B细胞定向单克隆抗体后无需正常B细胞也可生存。因此，临床上似乎没有因长期B细胞发育不全而产生的其他并发症。所有这些因素使得CD19成为研究的目标。
[0003]CAR
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T细胞旨在使患者的自体T细胞转化为对抗其B细胞淋巴瘤的强大杀伤细胞。CAR
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T(Chimeric Antigen Receptor T
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Cell Immunotherapy)，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。CART细胞旨在将患者的自体T细胞转化为对抗其B细胞淋巴瘤的强大杀伤细胞。通常通过单采血液分离术收集患者的T细胞，然后用慢病毒或逆转录病毒载体对其进行基因修饰，以表达包含抗体衍生抗原结合结构域、跨膜间隔子、共同刺激结构域(通常为CD28或4
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1BB)和细胞内信号传导域(CD3ζ)。这些原件在T细胞上的表达赋予抗体对T细胞的高亲和力抗原识别特性，然后当T细胞以MHC非依赖性方式与肿瘤抗原结合时，可以直接激活该抗体。
[0004]以往的CAR
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T研究方法都基于免疫缺陷小鼠模型。在免疫缺陷小鼠上种植人来源的肿瘤细胞，荷瘤成功后，再输入体外改造修饰完成的人来源的T细胞，以此来检测CAR
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T细胞的杀伤功效。有研究建立了一种新型的人源化小鼠模型。该模型也是采用免疫缺陷小鼠，但其将NSG小鼠进行亚致死照射之后静脉内移植人CD34
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胚胎肝细胞，使得人类的造血和免疫系统在小鼠体内得到完全重建。该种模型虽然可以运用于多种人类疾病模型，但其构建方式复杂，死亡率较高，成本较大。并且该小鼠中的非造血组织会干扰抗肿瘤免疫的过程。利妥昔单抗的问世使得DLBCL的生存率得到了显著的提升。但关于CD19或CD20的单抗研究也是基于免疫缺陷小鼠体内完成，尚不能完全模拟正常免疫条件下单克隆抗体对肿瘤细胞的杀伤作用。为此，寻找新的方法来模拟正常小鼠体内免疫环境来探索CART细胞疗法治疗急性淋巴细胞白血病或淋巴瘤是亟待解决的问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种表达人CD19抗原的淋巴瘤细胞株A20及其构建方法和应用，所述细胞株可在免疫功能正常的小鼠体内正常成瘤，不影响肿瘤细胞增殖与成瘤性，可用于模型小鼠构建。
[0006]本专利技术提供了一种表达人CD19抗原的淋巴瘤细胞株的构建方法，包括以下步骤：
[0007]1)将人CD19抗原序列插入pWPI载体上，得到重组pWPI载体；
[0008]2)将重组pWPI载体、PSPAX2和PMD2C1与转染试剂共同处理真核细胞，得到包装的病毒；
[0009]3)将所述包装的病毒感染淋巴瘤细胞，培养，得到表达人CD19抗原的淋巴瘤细胞株。
[0010]优选的，所述人CD19抗原序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1。
[0011]优选的，所述人CD19抗原序列的5'端添加一段kozak序列；
[0012]所述kozak序列的核苷酸序列如GCCACC所示。
[0013]优选的，所述pWPI载体的克隆位点为PacI/PmeI。
[0014]优选的，所述重组pWPI载体、PSPAX2和PMD2C1的质量比为(4～5)：3：(1～3)。
[0015]优选的，所述重组pWPI载体、PSPAX2和PMD2C1的总质量和转染试剂总体积的比例为10μg：(15～30)μl。
[0016]优选的，所述培养后，还包括对淋巴瘤细胞进行鉴定；
[0017]所述鉴定的方法包括qPCR检测和western检测；
[0018]所述qPCR检测用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物。
[0019]本专利技术提供了所述构建方法得到的表达人CD19抗原的淋巴瘤细胞株，所述淋巴瘤细胞株包含人CD19抗原编码序列。
[0020]本专利技术提供了所述表达人CD19抗原的淋巴瘤细胞株在构建肿瘤免疫小鼠模型中的应用。
[0021]优选的，所述肿瘤免疫小鼠模型包括急性淋巴细胞白血病小鼠模型和淋巴瘤小鼠模型。
[0022]本专利技术提供的所述构建方法得到的表达人CD19抗原的淋巴瘤细胞株，所述淋巴瘤细胞株包含人CD19抗原编码序列。本专利技术实验证明，通过慢病毒包装系统将人CD19抗原编码序列整合至淋巴瘤细胞中，经过qPCR检测，所述人CD19抗原编码序列能够在淋巴瘤细胞中稳定表达，同时采用western blot检测结果表明人CD19抗原能够在淋巴瘤细胞中稳定表达。与以往其他贴壁细胞为研究对象，无法模拟血液系统肿瘤的情况相比，本专利技术以小鼠淋巴瘤细胞为研究对象，成功构建了表达人CD19抗原的淋巴瘤细胞株。同时与以往人来源细胞仅能在免疫缺陷小鼠体内进行研究相比，本专利技术构建的表达人CD19抗原的淋巴瘤细胞株可以在免疫功能正常小鼠体内生长，可模拟正常人体内的免疫微环境，为靶向人CD19细胞的小鼠体内免疫疗法提供了新的肿瘤免疫模型，即为后续成功构建小鼠急性淋巴细胞白血病模型及淋巴瘤模型奠定基础。
附图说明
[0023]图1为本专利技术实施例中流式细胞术检测A20细胞hCD19及EGFP表达情况；
[0024]图2为采用qPCR检测hCD19
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A20细胞内EGFP表达量以及hCD19表达结果；
[0025]图3为本专利技术实施例中westernblot检测结果；其中，Raji是人CD19阳性细胞，作为阳性对照；A20
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CD19是转染筛选后的表达人CD19的小鼠淋巴瘤细胞；
[0026]图4为正常A20细胞与hCD19
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A20细胞生长性能的比较结果。
具体实施方式
[0027]本专利技术提供了一种表达人CD19抗原的淋巴瘤细胞株的构建方法，包括以下步骤：
[0028]1)将人CD19抗原序列插入pWPI载体上，得到重组pWPI载体；
[0029]2)将重组pWPI载体、PSPAX2和PMD2C1配制三质粒病毒包装系统，与转染试剂共同处理真核细胞，得到包装的病毒；
[0030]3)将所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种表达人CD19抗原的淋巴瘤细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将人CD19抗原序列插入pWPI载体上，得到重组pWPI载体；2)将重组pWPI载体、PSPAX2和PMD2C1与转染试剂共同处理真核细胞，得到包装的病毒；3)将所述包装的病毒感染淋巴瘤细胞，培养，得到表达人CD19抗原的淋巴瘤细胞株。2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述人CD19抗原序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1。3.根据权利要求1或2所述构建方法，其特征在于，所述人CD19抗原序列的5'端添加一段kozak序列；所述kozak序列的核苷酸序列如GCCACC所示。4.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述pWPI载体的克隆位点为PacI/PmeI。5.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，所述重组pWPI载体、PSPAX2和PMD2C1的质量比为(4...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘利，万卓，杨国栋，秦炜炜，梅瑞妍，范雯，
申请(专利权)人：中国人民解放军空军军医大学，
类型：发明
国别省市：