使用挂锁寡核苷酸组合单细胞基因表达作图和靶向RNA或c-DNA测序的方法技术

允许在单细胞水平下解析多个mRNA的显微镜检查成像，提供了有关转录物量和定位的有价值信息，其是用于理解组织异质性、分子发生和疾病治疗的关键因素。本发明专利技术描述了一种方法(Fly FISH)，所述方法组合了挂锁寡核苷酸作为荧光原位杂交(FISH)探针用于检测的应用与在细胞水平下对RNA或cDNA转录物的靶向部分进行测序，具有在可以分析的转录物量和序列长度方面的较少限制。在其核心中含有各种条形码的挂锁探针既用作FISH探针，也用于捕获可以测序的RNA部分。相同的条形码可以用于选择性地引发滚环扩增，并且扩增来自特定区域的转录物子集，其在探测步骤过程中已被标记为目的转录物。物。物。

【技术实现步骤摘要】
使用挂锁寡核苷酸组合单细胞基因表达作图和靶向RNA或c
‑
DNA测序的方法


[0001]本专利技术涉及通过包含条形码区域的挂锁寡核苷酸(padlock oligonucleotide)的选择性扩增，测序且定位RNA或c
‑
DNA链的方法。

技术介绍

[0002]挂锁寡核苷酸已证明在聚合它已与之杂交的短的核酸部分方面是非常成功的。大多数挂锁方法通过将靶逆转录成cDNA而开始。
[0003]挂锁方法例如公开于以下中：Lee等人“Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ”，Science. 2014年3月21日；343(6177): 1360
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1363. doi:10.1126/science.1250212，或者Nils Schneider和Matthias Meier的“Efficient In Situ Detection of mRNAs using the Chlorella virus DNA ligase for Padlock Probe Ligation”；2020年2月5日
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Cold Spring Harbor Laboratory Press。
[0004]用于人DNA序列的靶向多重扩增的综合测定由Sujatha Krishnakumar等人于2008年2月19日送审的PNAS公开。
[0005]进一步地，WO2017143155A2公开了使用合并的核酸文库的细胞的多重改变及其分析，并且WO2018045181A1公开了生成用于经由荧光原位测序检测的核酸序列文库的方法。
[0006]公开的挂锁方法允许DNA或RNA的测序，但没有给出所测序的DNA或RNA源于哪个特定细胞或组织位置的任何信息。
[0007]允许在单细胞水平下解析多个mRNA的显微镜检查成像，提供了有关转录物量和定位的有价值信息，其是用于理解组织异质性、分子发生和疾病治疗的关键因素。
[0008]基于荧光原位杂交(FISH)的方法允许在组织切片中直接标记转录物并捕获空间信息。然而，可以使用的探针数目是有限的，并且荧光信号的重叠经常是问题。此外，经常达到共聚焦显微镜检查的光学分辨率极限，并且因此可以伴随检测到的探针量降低。SeqFISH+是这样的方法，其不使用已经用荧光团标记的探针，而是使用含有条形码序列的转录物特异性探针，所述条形码序列充当荧光标记的二级探针的靶位点。使用在序贯轮的探测期间与这些条形码位点结合的二级探针，来鉴定各种靶特异性探针。通过限制由二级探针检测的探针量，有限量的探针发出荧光，并且因此可以辨别信号。收集多个分离的图像，并且通过计算聚合，以产生复合高分辨率图像，而无需高分辨率仪器显微镜。
[0009]然而，尽管这些方法允许同时评估几个基因，但并未捕获转录物的序列信息。基于单细胞RNA测序(scRNA
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seq)的其它方法，可以对整个转录组进行概况分析并捕获序列信息。然而，在组织或单细胞水平下的原始位置也经常丢失。以接近单细胞的分辨率捕获序列和空间信息两者的方法仍然是艰难挑战。一些方法已使用FISSEQ和BaristaSeq(另一种基于间隙填充挂锁的方法来实现该任务，具有约15个碱基的有限读取长度。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的是用于样品的单细胞基因表达作图和靶向RNA或c
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DNA测序的方法，所述样品包含至少一条RNA或c
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DNA链，所述方法包括以下步骤a. 提供包含50
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1000个核苷酸的具有5'和3'端的寡核苷酸，所述寡核苷酸与样品的所述至少一条RNA或c
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DNA链部分互补，其中所述寡核苷酸包含具有2
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20个核苷酸的至少一个条形码区域b. 使所述寡核苷酸在5'和3'端处与所述至少一条RNA或c
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DNA链的互补部分杂交，以产生在挂锁的5'和3'端之间具有间隙的挂锁c. 用互补核苷酸填充挂锁的间隙并将其连接，以生成单链环状模板，其中所述单链环状模板提供有能够结合条形码区域的至少一部分的至少一种检测探针d. 通过能够滚环扩增的聚合酶，将单链环状模板扩增成多个DNA多联体(concatemer)，形成rolonye. 确定单链环状模板的空间定位f. 确定单链环状模板的序列其特征在于所述检测探针包含能够结合条形码区域的至少一部分的具有2至20个核苷酸的寡核苷酸，以及选自磁性颗粒、荧光染料、放射性标记或抗原结合部分的检测区域。
[0011]在一个实施方案中，在步骤a)中，可提供由50
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1000个核苷酸组合的具有5'和3'端的寡核苷酸，所述核苷酸与样品的所述至少一条RNA或c
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DNA链互补，其中所述寡核苷酸包含具有2
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20个核苷酸的至少一个条形码区域。
[0012]在本专利技术中，已知的间隙填充挂锁技术通过使用栓系到检测探针，优选抗原结合部分的挂锁进行修改。检测探针可以任选地与组织交联。挂锁然后可以从检测探针中释放，并且在已进行固定和渗透化处理的组织切片上，与信使RNA的特定部分直接杂交。
[0013]在本专利技术的一个变体中，步骤e)和f)可以在挂锁而不是单链环状模板处执行。
附图说明
[0014]附图应解释本专利技术的方法及其实施方案，而不限制权利要求的范围。
[0015]图1显示了本专利技术的挂锁的实例，其也可以用作FISH(荧光原位杂交)探针。在挂锁的核心中，实施了一系列条形码或条形码区域，其可以用于通过与至少一个条形码区域(A)特异性结合的荧光标记的检测探针的一系列杂交，鉴定与mRNA结合的实际挂锁。挂锁的核心，即寡核苷酸，还可以含有通用结合位点(B)，用于结合由聚合酶用于滚环扩增步骤(RCA)的引物。如果使用选择性RCA，则使用与条形码区域之一结合的特异性引物。
[0016]进一步地，图1显示了用于非选择性RCA的可能引发位点(C和D)，以及与至少一条RNA或c
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DNA链的互补部分杂交的寡核苷酸的5'和3'端。在挂锁的5'和3'端之间产生的间隙(E)可以是0至500，优选小于200。
[0017]图2显示了使用识别特定组的条形码的寡核苷酸，在选择性/靶向RCA中使用存在关于其的空间信息的各种环化挂锁寡核苷酸库。这些寡核苷酸充当RCA反应的引物，并且DNA纳米球/rolony可以仅由选择的环化挂锁扩增。具体的扩增步骤显示于图2中，其中使用识别特定组的条形码的短寡核苷酸引物，在选择性/靶向RCA中使用已经获得关于其的空间
信息的各种单链环状模板库。这些短寡核苷酸充当RCA反应的引物，并且DNA纳米球/rolony仅由经选择且引发的环化挂锁生成。在所示的实例中，仅扩增由(B)标记的单链环状模板。
[0018]图3显示了间隙填充挂锁探针技术，其使用的探针与组本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于样品的单细胞基因表达作图和靶向RNA或c
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DNA测序的方法，所述样品包含至少一条RNA或c
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DNA链，所述方法包括以下步骤a. 提供包含50
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1000个核苷酸的具有5'和3'端的寡核苷酸，所述寡核苷酸与样品的所述至少一条RNA或c
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DNA链部分互补，其中所述寡核苷酸包含具有2
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20个核苷酸的至少一个条形码区域b. 使所述寡核苷酸在5'和3'端处与所述至少一条RNA或c
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DNA链的互补部分杂交，以产生在挂锁的5'和3'端之间具有间隙的挂锁c. 用互补核苷酸填充挂锁的间隙并将其连接，以生成单链环状模板，其中所述单链环状模板提供有能够结合条形码区域的至少一部分的至少一种检测探针d. 通过能够滚环扩增的聚合酶，将单链环状模板扩增成多个DNA多联体，形成rolonye. 确定单链环状模板的空间定位f. 确定单链环状模板的序列其特征在于所述检测探针包含能够结合条形码区域的至少一部分的具有2至20个核苷酸的寡核苷酸，以及选自磁性颗粒、荧光染料、放射性标记或抗原结合部分的检测区域。2.根据权利要求1的方法，其特征在于所述检测探针提供有光可交联的单元，其能够在步骤c)期间或之后，在用光照射时，将单链环状模板与样品光交联。3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于在步骤c)之后，从所述单链环状模板中去除检测探针。4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于在步骤e)之后，将所述单链环状模板剪切成片段，并且所述片段通过能够滚环扩增的聚合酶，扩增成第二多个DNA多联体，形成rolony。5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：美天施生物科技有限两合公司，
类型：发明
国别省市：