一种基于NGS技术检测四种类型129个分子遗传标记的复合扩增体系制造技术

本发明专利技术属于法医学新技术创新研究应用领域，具体涉及公开一种基于二代测序平台检测多种分子遗传标记的复合扩增体系。本发明专利技术基于HGDP

【技术实现步骤摘要】
一种基于NGS技术检测四种类型129个分子遗传标记的复合扩增体系


[0001]本专利技术属于法医学新技术研究应用领域，具体涉及公开一种基于二代测序检测平台（Next generation sequencing, NGS），建立的四种类型新的129个分子遗传标记的复合扩增体系，包括系统甄选的始祖信息单核苷酸多态性（ancestry informative single nucleotide polymorphism, AISNP）、多等位基因缺失/插入多态性（insertion/deletion polymorphism, InDel）、微单倍型和Y染色体SNP/InDel分子遗传标记的复合扩增体系及其分析检测方法。

技术介绍

[0002]法医学的始祖信息分析有利于揭示未知名个体的生物地理起源，有助于通过缩小调查范围，来协助司法侦查工作。目前，法医学中常用的始祖信息分析体系多是针对不同洲际群体，这些体系不适于国内群体的鉴别研究。因此，筛选一些用于国内群体法医学始祖分析的位点，不仅可进一步优化现有的始祖分析体系，也有利于我国不同族群的鉴别研究，进而为法医学应用提供更有价值的信息。
[0003]短串联重复序列（short tandem repeats, STR）是法医学个体识别和亲缘关系鉴识研究中常用的遗传标记。不过，STR存在扩增子较长和突变率较高的不足，尤其是在检测高度降解的检材或分析疑难亲缘关系时应用受限。SNP和InDel遗传标记作为第三代遗传标记，相比STR，具有较低突变率和易获得较小扩增子的优势，近几年在法医学研究中得到了广泛的应用。然而，目前常用的SNP和InDel多为二等位基因变异，它们的多态性较低，也不利于混合样本的解晰研究。对此，法医学者开始筛选多等位基因SNP位点以求获得更高的多态性。这种类型的SNP可表现出多个等位基因变异，但理论上最多存在四个等位基因。相比多等位基因SNP位点，多等位基因InDel位点理论上可提供更多的等位基因变异，因此，它们有望获得更高的法医学应用价值，尤其是对于混合样本的解晰研究。
[0004]微单倍型作为一种新型分子遗传标记，相比常用的STR位点，其由一段较短的DNA序列区域内两个或者两个以上的SNP位点组成，其具有可获得较小的扩增子、拥有较低的突变率和PCR过程中无stutter峰的优势。此外，微单倍型的等位基因是一个区域内的多个SNP组成的单倍型，在群体中可表现出多个单倍型的变异，因此，它们可表现出更高的多态性和更好的法医学系统效能，在法医学司法实践中具有很好的应用价值。
[0005]Y
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SNP位点拥有极低的突变率，且Y染色体表现出父系遗传的特征。据此，可采用Y
‑
SNP位点推测男性个体的父系起源。采用Y
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SNP位点推测个体的单倍群分布信息，可为法医学、群体遗传学、人类学等研究提供有价值的信息。Y
‑
InDel位点可用于性别鉴定。
[0006]NGS技术可通过检测待测片段的碱基序列实现位点的序列分型检测；其对遗传标记的检测不受标记的荧光物质的限制，故可实现大量位点的同步分型检测分析。此外，NGS具有极好的兼容性，可实现多种类型分子遗传标记的同步检测分析。因此，NGS技术在法医学研究中具有极好的应用前景，可为法医学研究提供更有价值的信息。
[0007]本专利技术采用NGS技术，通过多重PCR的方法，实现AISNP、多等位基因InDel、微单倍型和Y
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SNP/InDel在内的四种类型分子遗传标记共计129个位点的同步检测分析，可通过检测一份现场检材实现法医学的个体识别、亲缘关系鉴识、混合样本解晰和法医学始祖分析以及男性个体单倍群的分布研究。。

技术实现思路

[0008]在此处。本专利技术的目的是提供一种包含AISNP、多等位基因InDel、微单倍型和Y
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SNP/InDel在内的多种遗传标记的复合扩增体系及其分型检测方法。
[0009]为了实现本专利技术，我们采用了以下技术方案：1. 四种类型129个分子遗传标记的甄选1）AISNP位点的筛选。首先，我们以HGDP
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CEPH报道的东亚、欧洲、非洲和美洲群体的数据集为基础，采用以下原则筛选适于不同洲际群体鉴别研究的AISNP位点：a. SNP位点在不同洲际群体间的频率差异在0.3以上；b. SNP位点位于不同染色体上或在同一染色体上的物理距离大于10Mb；c. SNP位点位于内含子区域；d. 选择的SNP位点在所有参考群体中符合哈迪温伯格平衡（Hardy
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Weinberg equilibrium, HWE）；e. SNP位点为二等位基因变异。然后，对选出来的位点进一步甄选，筛选出那些在国内汉族、维吾尔族和蒙古族群体间的频率差异在0.3以上的位点。根据以上原则，共筛选出48个AISNP位点。这48个AISNP位点的引物信息（Seq1
‑
Seq96）见表1.表1：48个AISNP位点的引物信息
2）多等位基因InDel位点的筛选。基于千人基因组计划中报道的不同洲际群体的遗传数据筛选多等位基因InDel位点，位点的筛选原则如下：a. 多等位基因InDel位点在东亚群体中的最小等位基因频率大于0.1；b. 多等位基因InDel位点位于不同染色体上或在同一染色体上物理距离大于10Mb；c. 多等位基因InDel位点插入/缺失的片段大小在30bp以内；d. 多等位基因InDel位点在东亚群体中符合HWE；e. 多等位基因InDel位点在东亚群体中表现为多等位基因（>2）变异。基于以上原则，确定18个多等位基因InDel位点，这些位点的引物信息（Seq97
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Seq132）见表2。
[0010]表2:18个多等位基因InDel位点的引物序列
3）微单倍型位点的筛选。对于微单倍型位点，基于我们课题组和其他人的研究报道，筛选出那些在国内群体中表现出较高多态性的微单倍型位点，共确定27个微单倍型位点，这些位点的引物信息（Seq191
‑
Seq300）见表3。
[0011]表3： 27个微单倍型位点的引物信息
4）Y
‑
SNP/InDel位点的筛选。基于既往的研究报道，我们选择34个Y
‑
SNP位点用于男性个体单倍群的分布研究。此外，我们也选择两个Y
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InDel位点用以男性个体的鉴别研究。36个Y染色体遗传标记的引物信息（Seq301
‑
Seq372）见表4。
[0012]表4： 36个Y
‑
SNP/InDel位点的引物信息
2. 筛选的位点复合扩增体系的构建。本专利技术采用Primer Premier 6.0软件对48个AISNP、18个多等位基因InDel、27个微单倍型和36个Y
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SNP/InDel位点进行引物设计。基于获得的引物序列，通过调整引物的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
Buffer，瞬时离心后，将所有反应液转移至新的离心管中；吸取170
µ
L DNA Clean Beads加至上一步的溶液中，用移液器轻轻吹打至完全混匀，室温孵育5 min；将离心管置于磁力架，静置5 min至液体澄清，用移液器吸取、丢弃上清；保持离心管于磁力架上，加入500
µ
L新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠及管壁，静置30 s后吸取、丢弃上清，重复该步骤1
‑
2次；保持离心管固定于磁力架上，室温干燥至磁珠表面无反光和开裂；将离心管从磁力架上取下，加入25
µ
L TE Buffer进行DNA洗脱，用移液器轻轻吹打至完全混匀...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱波峰，靳小业，崔伟，陈冲，
申请(专利权)人：靳小业崔伟陈冲，
类型：发明
国别省市：