基于高通量测序技术的动物源性成分检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于高通量测序技术的动物源性成分检测方法及其应用，属于生物技术领域；该方法包括以下步骤：（1）样品DNA提取，（2）一步PCR扩增，（3）MiSeq测序，（4）SAFESeqr Suite数据分析。本发明专利技术所述的基于高通量测序技术的动物源性成分检测方法，该检测方法对提取的样品DNA直接进行高通量测序分析，保证了足够的数据量，设计通用引物能同时确定掺有多个不同物种的肉制品，并能确定每个物种在肉制品中的相对含量，实现未知动物源性成分的快速鉴定和掺假、掺杂的精确测定，采用该方法能同时进行96个混合样品的成分及组分分析，灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短。检测时间短。检测时间短。

【技术实现步骤摘要】
基于高通量测序技术的动物源性成分检测方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于高通量测序技术的动物源性成分检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]近年来，我国食品业进入了飞速发展的黄金时期，禽畜类肉制品及其制品丰富了广大人民群众的餐桌，肉类食品是人们获取高质量蛋白的主要渠道，肉类食品的质量与人类健康密切相关。然而近年来，食品的掺假现象频繁出现，肉制品掺伪是较为常见的一类食品掺假现象，主要是一些不法商贩为谋取利益，向肉制品中掺入甚至是替换为形态相似的、价格较为廉价的非同种肉类。以“马肉风波”事件为例，2013年在英国等欧洲国家的许多大型超市的牛肉产品中检测到了马肉成分。这些掺假的肉类大多没有经过检疫部门的审查，甚至是有一些事非食用肉类，这些不明来源的肉类可能会携带未知的致病菌，或者含有一些有害化学成分，给消费者身体健康带来严重的影响。为了更加有效地监管和控制此类现象的发生，尽可能的阻止这类掺假肉类流入消费者手中，建立有效的动物源性成分检测方法不仅可以有力的打击不法商贩，并能有针对性的采取措施以减少此类现象的发生。
[0003]一直以来，国内外众多学者也对动物源性成分的检测技术进行了大量的研究，现阶段可用于肉类食品成分鉴定的基因通常位于线粒体(mtDNA)上，包括细胞色素b(Cytb)基因、细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因、12SrDNA、16SrDNA、D
‑
loop基因等。目前，国内外用于肉制品的掺假、掺杂检验以PCR
‑
RFLP、多重PCR、实时定量PCR等方法为主。但是，这些技术一般每次仅能检测一种或两种指标，无法全面分析检测食品中所涉及的多种动物源性成分，当遇到几个不同品种的混合样品时，要确定每个品种在混合物中的相对量需要找到品种中唯一的已知目标序列作为参考序列，而且要获得精确的测定结果非常困难，而且现有检测方法对操作人员技术、实验室仪器设备配置要求较高，检测成本昂贵，难以满足高效快速、批量大、大规模、操作简单等检测需求，无法满足市场监管、企业原料及成品质量实时控制的迫切需求。因此研发一种方便快速、灵敏度高、成本低、检测时间短、测定准确和高通量的检测方法实现对未知动物源性成分的快速鉴定和掺假、掺杂的精确测定将有利于执法部门快速准确鉴别动物源性成分，提高职能部门的检测能力。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足而提供的一种基于高通量测序技术的动物源性成分检测方法及其应用。该检测方法对提取的样品DNA直接进行高通量测序分析，保证了足够的数据量，设计通用引物能同时确定掺有多个不同物种的肉制品，并能确定每个物种在肉制品中的相对含量，实现了对未知动物源性成分的快速鉴定和掺假、掺杂的精确测定。
[0005]为达到上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：基于高通量测序技术的动物源性成分检测方法，包括以下步骤：
（1）样品DNA提取；（2）一步PCR扩增；（3）MiSeq测序；（4）SAFESeqr Suite数据分析；所述步骤（2）一步PCR扩增方法如下：a1. 设计引物PR2
‑
F和PR2
‑
R扩增各样品的短片段序列；其中，引物PR2
‑
F: 5
’‑ꢀ
ATAAGACGAGAAGACCCT
‑3’
引物PR2
‑
R: 5
’‑ꢀ
ACATCGAGGTCGTAAACC
‑3’
b1. 在扩增引物PR2的5
’
端加入Illumina测序接头和标签序列以区分不同样品；c1. PCR反应体系为25μL，其中FailSafe PCR 2
×
PreMix F 12.5μL、FailSafe PCR Enzyme Mix 0.5μL、正反向引物(5μM)各2μL、gDNA (1ng/μL)2μL、超纯水6μL，一步PCR反应程序{96℃，5min；25循环（96℃，45s；45℃，45s；72℃，45s）； 72℃，3min}，得到PCR产物；用超纯水替代样品中gDNA作为阴性对照(NTC)，平行制备三份；d1. 将得到的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，目的片段大小为400bp～500bp。
[0006]进一步的，所述步骤（1）样品DNA提取方法为：将肉制品剪碎研磨，称取100~300mg样品用深加工食品DNA提取试剂盒提取样品总DNA。
[0007]进一步的，所述步骤（3）MiSeq测序步骤为：用AMPure XP beads纯化各样品PCR产物，通过1%的琼脂糖凝胶电泳确认是否去除杂带片段，用Qubit
® Fluorometer对纯化后的PCR产物定量分析，并统一稀释成4nM，将各样品以及PhiX Control一同构成测序样品文库，变性处理后，采用MiSeq Reagent Kit v2 (500
‑
cycles)试剂盒上机测序。
[0008]进一步的，所述步骤（4）SAFESeqr Suite数据分析步骤为：将测序获得的样品Read1和Read2的FASTQ文件导入SAFESeqr Suite，分析得到样品成分及组分结果。所用到的SAFESeqr Suite软件的相关介绍见如下网站：进一步的，所述的引物PR2
‑
F和PR2
‑
R的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
[0009]所述的基于高通量测序技术的动物源性成分检测方法，所述方法的分类数据库包含＞1500个属、＞2700个种的动物16s rRNA基因序列信息。
[0010]本专利技术的另一目的在于提供所述的基于高通量测序技术的动物源性成分检测方法在肉制品掺假、掺杂检验中的应用。
[0011]相对于现有技术，本专利技术一种基于高通量测序技术的动物源性成分检测方法及其应用具有以下优势：（1）本专利技术提供的基于高通量测序技术的动物源性成分检测方法，该检测方法对提取的样品DNA直接进行高通量测序分析，保证了足够的数据量，设计通用引物能同时确定掺有多个不同物种的肉制品，并能确定每个物种在肉制品中的相对含量，实现未知动物源性成分的快速鉴定和掺假、掺杂的精确测定。
[0012]（2）本专利技术提供的基于高通量测序技术的动物源性成分检测方法，构建的数据库包含了硬骨鱼纲、软骨鱼纲、哺乳纲、鸟纲、爬行纲等1500多个属、2700多个种的物种，能够准确、有效地鉴定未知动物源性成分。
[0013]（3）本专利技术所述的基于高通量测序技术的动物源性成分检测方法，一步PCR扩增提
高了检测的效率，节省了时间和人力成本。
[0014]（4）相比于现有的动物源性成分检测方法，本专利技术所述的基于高通量测序技术的动物源性成分检测方法，该方法能同时进行96个混合样品的成分及组分分析，灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短，准确度高，检测限为0.1%和1μg。该检测方法能够满足高效快速、批量大、大规模、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于高通量测序技术的动物源性成分检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）样品DNA提取；（2）一步PCR扩增；（3）MiSeq测序；（4）SAFESeqr Suite数据分析；所述步骤（2）一步PCR扩增方法如下：a1. 设计引物PR2
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F和PR2
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R扩增各样品的短片段序列；其中，引物PR2
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F: 5
’‑ꢀ
ATAAGACGAGAAGACCCT
‑3’
引物PR2
‑
R: 5
’‑ꢀ
ACATCGAGGTCGTAAACC
‑3’
b1. 在扩增引物PR2的5
’
端加入Illumina测序接头和标签序列以区分不同样品；c1. PCR反应体系为25μL，其中FailSafe PCR 2
×
PreMix F 12.5μL、FailSafe PCR Enzyme Mix 0.5μL、正反向引物(5μM)各2μL、gDNA (1ng/μL)2μL、超纯水6μL，一步PCR反应程序{96℃，5min；25循环（96℃，45s；45℃，45s；72℃，45s）； 72℃，3min}，得到PCR产物；用超纯水替代样品中gDNA作为阴性对照(NTC)，平行制备三份；d1. 将得到的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，目的片段大小为400bp～500bp。2.根据权利要求1所述的基于高通量测序技术的动物源性成分检测方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：甘永琦，朱斌，樊兰艳，
申请(专利权)人：广西壮族自治区食品药品检验所，
类型：发明
国别省市：