核酸序列的直接电读出制造技术

公开了用于直接测量聚合酶活性的设备、系统和方法。在一个实例中，设备包括至少第一电极和第二电极，所述第一电极和第二电极被间隙隔开；以及聚合酶，其具有两个附接位点，一个附接位点用于附接到所述第一电极，而第二附接位点用于附接到所述第二电极，其中所述两个附接位点被至少约1nm的距离隔开，并且所述距离不会随着所述聚合酶的构象变化而显著变化。会随着所述聚合酶的构象变化而显著变化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸序列的直接电读出
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本公开要求于2019年6月20日提交的美国临时专利申请第62/864,174号的较早提交日期的优先权益，该临时专利申请通过引用整体并入本文。
[0003]政府支持条款的确认
[0004]本专利技术是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的R21 HG010522和R01 HG009180下通过政府支持完成的。政府对本专利技术拥有某些权利。
[0005]序列表参考
[0006]本申请通过引用并入了以计算机可读形式提交的序列表，该序列表创建于2020年6月19日，包含6千字节。


[0007]本公开内容涉及测序，尤其涉及用于直接测量聚合酶活性的设备、系统和方法。

技术实现思路

[0008]本文公开了用于直接测量聚合酶活性的设备、系统和方法。
[0009]在一些实施方案中，提供了设备，该设备包括：至少第一电极和第二电极，第一电极和第二电极被间隙隔开；以及聚合酶，其包含两个用于附接到第一电极和第二电极的位点，其中两个附接位点被至少约1nm的距离隔开，并且该距离没有随聚合酶的构象变化而明显变化(即总距离的变化小于10％)，诸如当聚合酶处于开放或封闭构象时，该两个附接位点具有相同的原子坐标。
[0010]在一些实施方案中，提供了系统，该系统包括如本文所述的并且被配置为实践本文公开的一种或多种方法的设备。
[0011]在一些实施方案中，提供了检测核苷酸掺入的方法，该方法包括：(a)将包含核酸模板的溶液引入到如本文所述的设备中；(b)测量当对设备施加偏压时产生的第一电流；(c)在允许掺入与核酸模板互补的dNTP的条件下，将包含dNTP的溶液引入到设备中；(d)测量步骤(c)中产生的第二电流；(e)去除包含未掺入的dNTP的溶液；(f)重复步骤(c)至(e)；(g)从步骤(b)和步骤(d)中产生的电流获得信号流；(h)识别在两个电流电平之间波动的一段电流信号，持续超过大约40ms的时间；以及(i)如果信号流包含停顿，则检测到核苷酸已被掺入。
[0012]在一些实施方案中，提供了确定核酸模板序列中重复的核酸数量的方法，该方法包括：(a)将包含核酸模板的溶液引入到如本文所述的设备中；(b)测量当对设备施加偏压时产生的第一电流；(c)在允许掺入与核酸模板互补的dNTP的条件下，将包含dNTP的溶液引入到设备中；(d)测量步骤(c)中产生的第二电流；(e)去除包含未掺入的dNTP的溶液；(f)重复步骤(c)至(e)；(g)从步骤(b)和步骤(d)中产生的电流获得信号流，其中信号流包含至少一个停顿和至少一个猝发；(h)识别在两个电流电平之间波动的一段电流信号，持续超过大约40ms的时间；以及(i)如果信号流包含约为信号流中多个停顿长度的两倍的停顿，则确定
核苷酸已在核酸模板序列中重复。
[0013]在一些实施方案中，提供了确定正被掺入到核酸模板序列中的核苷酸的身份(identity)的方法，该方法包括：(a)将包含核酸模板的溶液引入到如本文所述的设备中；(b)测量当对设备施加偏压时产生的第一电流；(c)在允许掺入与核酸模板互补的dNTP的条件下，将包含dNTP的溶液引入到设备中；(d)测量步骤(c)中产生的第二电流；(e)去除包含未掺入的dNTP的溶液；(f)重复步骤(c)至(e)；(g)从步骤(b)和步骤(d)中产生的电流获得信号流，其中信号流包含至少一个停顿和至少一个猝发；以及(h)从猝发信号确定掺入的核苷酸的身份。
[0014]在一些实施方案中，提供了对核酸序列进行测序的方法，该方法包括：(a)将包含核酸模板的溶液引入到如本文所述的设备中，其中核酸模板包含序列中两个连续碱基的全部16个可能组合；(b)在允许掺入与核酸模板互补的dNTP的条件下，将包含dNTP的溶液引入到设备中；(c)从核酸模板中的重复序列获得信号流，其中信号流包括至少一个停顿和至少一个猝发；(d)使用信号分析来表征每个掺入的dNTP的猝发信号；以及(e)应用信号分析对未知核酸序列进行测序。
[0015]本公开的前述和其他特征从以下详细描述来看将变得更加明显，该详细描述参考附图进行。
附图说明
[0016]结合附图和随附的权利要求书，通过以下详细描述将很容易理解实施方案。实施方案在附图中通过示例而非限制的方式示出。
[0017]图1Ai至图1Aiii示出了具有至少一个接触点的聚合酶的示意图。图1A
‑
i示出了在N末端具有单个Avitag(序列N接触点1)的Ф29聚合酶。图1A
‑
ii示出了在E279和D280之间插入了第二Avitag(序列接触点2)的Ф29聚合酶。图1Ai
‑
iii示出了具有两个Avitag并在N末端序列中具有额外的柔性接头(序列N接触点2)的Ф29聚合酶。
[0018]图1B示出了SDS
‑
PAGE凝胶，其在泳道2中显示出Gen III修饰的聚合酶。与链霉亲和素一起孵育时，主要产物(红色箭头)是质量约等于聚合酶加两个链霉亲和素分子的复合物。泳道4是WT链霉亲和素。
[0019]图1C示出了琼脂糖DNA凝胶，其显示出来自使用(泳道1)Ge n III聚合酶和(泳道4)与链霉亲和素复合的聚合酶的滚环聚合测定的延长产物。滚环模板是5
’‑
P
‑
CCGTACGATTCGTATCTACTATCGTTCGATTCGCATCATCTA
‑3’
(SEQ ID NO:4)，且用于形成双链区的引物是5
’‑
GGCATGCTAAGCATAGATGAT
‑3’
(SEQ ID NO:5)。
[0020]图2示出了所用DNA模板的序列及其折叠结构(SEQ ID NO:6
‑
14)。
[0021]图3A和图3B示出了均聚物序列(图3A)和非均聚物序列(图3B)的尿素
‑
PAGE凝胶(变性凝胶(20％聚丙烯酰胺
‑
8M尿素)。所述模板均含有发夹，因此在变性凝胶(20％聚丙烯酰胺
‑
8M尿素)上，如果产物完全延伸，其会显示为尖锐的较高分子量条带。图3A显示A10有时完全延伸，如由第一泳道中存在一些完全延伸的产物所证明的；C10根本不延伸；并且A10C10可形成少量的延伸产物，但聚合通常在两个位置突然停止。均聚物模板未能完全延伸。图3B显示非均聚物序列(ATC)15很容易延伸到完成。
[0022]图4示出了DNA序列(SEQ ID NO:15)和形成3、6和9个碱基对(SEQ ID NO:16
‑
18)的
切口的引物。
[0023]图5A示出了由聚合酶桥接的一对电极的示意图。
[0024]图5B示出了由三个聚合酶分子桥接的一对电极的示意图。
[0025]图6示出了从如本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于对核酸进行测序的设备，其包括：至少第一电极和第二电极，所述第一电极和第二电极被间隙隔开；以及聚合酶，其包含两个附接位点，第一附接位点用于将所述聚合酶附接到所述第一电极，而第二附接位点用于将所述聚合酶附接到所述第二电极，其中所述两个附接位点被至少约1nm的距离隔开，并且当所述聚合酶附接到所述第一电极和第二电极时，所述第一附接位点和所述第二附接位点在所述聚合物经受开放至闭合的构象变化时不会发生超过它们的离距(separation)的10％的相对于彼此的运动。2.如权利要求1所述的设备，其中所述聚合酶的所述两个附接位点都在所述聚合酶的非活性区中。3.如权利要求1或权利要求2所述的设备，其中所述两个附接位点之一位于所述聚合酶的n末端。4.如权利要求1
‑
3中任一项所述的设备，其中所述聚合酶的至少所述第一附接位点被特异性地化学修饰成附接至所述第一电极。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的设备，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。6.如权利要求5所述的设备，其中所述DNA聚合酶是phi29聚合酶。7.如权利要求1
‑
4中任一项所述的设备，其中所述聚合酶是RNA聚合酶。8.如权利要求7所述的设备，其中所述RNA聚合酶是脊髓灰质炎病毒3D RNA依赖性RNA聚合酶。9.如权利要求1
‑
8中任一项所述的设备，其中所述聚合酶被修饰成掺入了配体结合位点。10.如权利要求1
‑
9中任一项所述的设备，其中所述聚合酶是生物素化聚合酶。11.如权利要求10所述的设备，其中所述聚合酶是生物素化聚合酶，并且通过链霉亲和素附接到所述第一电极和/或第二电极。12.如权利要求1
‑
11中任一项所述的设备，其中所述聚合酶被修饰成掺入了非典型氨基酸残基，所述非典型氨基酸残基允许将一个或多个其他化学基团以点击化学方式附接至所述第一电极和/或第二电极。13.如权利要求12所述的设备，其中所述非典型氨基酸是4
‑
叠氮基
‑
L
‑
苯丙氨酸。14.如权利要求1
‑
13中任一项所述的设备，其中当所述聚合酶处于开放或闭合构象时，所述第一附接点和第二附接点的原子坐标相同到差异在10％以内。15.如权利要求1
‑
14中任一项所述的设备，其中所述第一电极和第二电极包含选自由金、铂、钯和钌或其合金组成的组的金属。16.如权利要求1
‑
15中任一项所述的设备，其中所述第一电极和第二电极是共面的。17.如权利要求1
‑
15中任一项所述的设备，其进一步包含介电基底，其中所述第一电极设置在所述介电基底上，并且绝缘介电层设置在所述第一电极上，并且所述第二电极设置在所述绝缘介电层上；以及设置在所述第二电极上的钝化层。18.一种系统，其包括权利要求1
‑
17中任一项所述的设备和核酸模板。19.如权利要求18所述的系统，其中所述核酸模板是双链DNA模板，其包含至少一个超过一个核苷酸的缺口。20.如权利要求19所述的系统，其中所述至少一个超过一个核苷酸的缺口具...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯图尔特林赛，张宾天，邓汉清，
申请(专利权)人：代表亚利桑那大学的亚利桑那校董事会，
类型：发明
国别省市：